用于LAMP扩增反应试剂及其配制方法与流程

用于lamp扩增反应试剂及其配制方法
技术领域
1.本发明涉及生物实验试剂领域，特别是涉及一种用于lamp扩增反应试剂及其配制方法。


背景技术：

2.环介导等温扩增法，是一种新型的核酸扩增方法，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要pcr仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
3.ph指示剂显色是lamp试剂的常用检测方案，然而在试剂配制过程中，由于基于ph指示剂显色的lamp试剂缓冲能力差且不同成分需分开添加，操作繁琐批次效应极大，不同批次试剂的显色效果之间具有很明显的差异。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种无缓冲lamp扩增试剂tre红黄变色2*lamp mix试剂及其配制方法，用于解决现有技术中敏感性低，稳定性差的缺点。敏感性低指现有试剂需要的反应时间在40-60min反应时间较长；二稳定性低，是指由于现有技术的配方和配制方法不够科学产生的，不同批次之间ph指示终点不完全一致而产生实验误差较大问题。本发明对这两方面同时进行了改进，首先，优化了传统lamp体系的反应成分浓度，采用更低浓度的显色指示剂和低ph，减少了显色指示剂对lamp反应的影响，提升了扩增效率增加了试剂敏感度，使得反应时间由40-60min降低到15分钟以内；其次，优化了试剂配制方法，采用国产原材料科学配比，在效率提升的基础上成本降低10倍以上。而且由于生产流程的优化，不同批次产物的稳定性得到加强。
5.本发明提供了一种用于lamp扩增反应试剂的配制方法，所述方法包括以下步骤：
6.1)依次按照以下顺序加入各组分：kcl、(nh4)2so4、mgso4、酚红溶液、triton x-100或者吐温20，然后加入去离子水，调节ph，获得混合液；
7.2)依次按照以下顺序加入各个组分：去离子水、步骤1)中获得的混合液、dntp、bst dna聚合酶。
8.进一步地，所述步骤1)中kcl的终浓度为300-800mm；(nh4)2so4的终浓度为100-200mm，mgso4的终浓度为10-20mm，酚红溶液中酚红的终浓度为100-500mm，triton x-100的终浓度为0.1-0.5％。
9.进一步地，所述步骤1)中kcl的终浓度为500mm；(nh4)2so4的终浓度为100mm，mgso4的终浓度为12mm，酚红溶液中酚红的终浓度为300mm，triton x-100的终浓度为0.50％(质量体积比)。
10.进一步地，所述步骤1)中调节ph至8～8.5，优选为8.4。
11.进一步地，所述步骤1)中还包括对制备获得的混合液进行震荡混匀。本领域技术人员可以采用现有技术中的震荡混匀方式进行混匀，可以采用摇床或者超声混匀的方式；优选的方式为超声混匀。
12.进一步地，所述步骤1)中还包括对震荡后的混合液进行除菌；优选的方式为过滤除菌。
13.进一步地，所述步骤2)中各个组分的体积比为去离子水：步骤1)中获得混合液：dntp：bst 2.0dna聚合酶＝2.5:1.25:2:0.5。
14.本发明的另一方面提供了一种用于lamp扩增反应的tre红黄变色2*lamp mix试剂试剂，所述试剂采用上述方法制备而成。
15.本发明的另一方面提供了上述用于lamp扩增反应的试剂用于lamp扩增反应的用途。
16.如上所述，本发明的用于lamp扩增反应的试剂，具有以下有益效果：
17.我们制备的试剂优化了传统lamp体系的反应成分浓度，采用更低浓度的显色指示剂和低ph，减少了显色指示剂对lamp反应的影响，提升了扩增效率增加了试剂敏感度，使得反应时间由40-60min降低到15分钟以内；其次，优化了试剂配制方法，采用国产原材料科学配比，在效率提升的基础上成本降低10倍以上。而且由于生产流程的优化，不同批次产物的稳定性得到加强。
18.附图标记
19.图1显示为我们研制的反应液与neb进口酶同时不同批次颜色差异。
20.图2显示为我们研制的反应液与neb进口酶加热后的颜色变化。
21.图3显示我我们研制的反应液与neb进口酶同时进行lamp反应，获得的产物进行凝胶电泳后的电泳照片。
具体实施方式
22.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
23.实验材料和仪器：
24.实验仪器：去离子水纯水系统，水平摇床，ph检测仪
25.耗材：0.22μm水相针式过滤器，10ml注射器
26.实施例1染色剂使用液配制
27.染色剂储存液：称取17.7mg酚红粉末于2ml ep管中，加入400μl dmso震荡混匀至完全溶解，放-20℃保存。
28.染色剂使用液：取250μl上述酚红的dmso溶液于50ml试管中，加去离子水定容到50ml，获得终浓度为500μm的染色剂使用液。
29.实施例2 10*lamp reaction sensitive buffer配制
30.按表1配制10*lamp reaction sensitive buffer：按表中顺序添加成分配制，之后将混合溶液放置于超声震荡仪震荡5-10min(功率40％，温度25℃)，使混合液中沉淀完全溶解，得到透明的橙黄色溶液。将配制好的溶液经过0.22μm水相过滤膜过滤除菌后分装，于-20℃长期保存，且在未被污染的情况下，室温保存两周左右不影响lamp反应效果。(注意：1.配制好后禁止剧烈震荡，否则将产生大量气泡；2.可用tween 20代替triton x-100。)表1 10*lamp reaction sensitive buffer配方
[0031][0032]
实施例3 2*lamp mix配制
[0033]
按表2配制2*lamp mix配制，按照表中顺序从上到下添加，配置完成后，震荡混匀瞬时离心。
[0034]
表2 2*lamp mix配方
[0035][0036]
实施例4lamp扩增反应的试剂
[0037]
取少量自研tre红黄变色2*lamp mix试剂，按照表3配制lamp反应体系，震荡混匀瞬时离心，用neb lamp reaction 2*mix作为对照，对比检验如下指标：
[0038]
若自研tre红黄变色2*lamp mix试剂与neb试剂配制的lamp反应体系对比，反应前后颜色变化相近，dna电泳产物类似，则认为试剂配制成功。
[0039]
表3lamp反应体系
[0040]
[0041]
1、lamp反应体系加热前与neb试剂配制的反应体系进行颜色对比：购买的neb试剂，其不同批次颜色差异较大如图1所示，现有neb试剂不同批次的颜色有深紫、淡紫、省红三种颜色状态，由于实验结果是由试剂的颜色变化判断的，导致不同批次neb试剂得到的实验结果不稳定，不同批次的实验结果之间无法互相对照，极大的影响了实验结果的准确性，限制了lamp技术在生物医学领域的应用，而我们研发的tre试剂，不同批次之间颜无差异，实验结果之间可以互相对照，解决了这一难题。
[0042]
2、两种体系分别于65℃水浴锅，加热15min后进行颜色对比；
[0043]
如图2所示，neb试剂在65℃水浴锅，加热15min后，试剂颜色无变化，这是由于变色反应未到临界点，而我们自研tre红黄变色2*lamp mix试剂已经明显发生颜色变化，说明自研tre红黄变色2*lamp mix试剂具有更高的灵敏度。
[0044]
3、将反应后的lamp反应液，取5μl用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳实验，对比反应产物的dna条带，结果如图3。两款试剂产生的电泳条带相同，说明均发生了lamp扩增反应，但在15min时，仅tre红黄变色2*lamp mix发生颜色改变。
[0045]
以上结果表明，我们研制的反应液能区分开阴性和阳性样本，且自研tre红黄变色2*lamp mix试剂具有更高的灵敏度。
[0046]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。