一种高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株的构建方法和应用

1.本发明属于生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株的构建方法和应用。


背景技术：

2.酪氨酸酶(ec1.14.18.1，tyrosinase，tyr)，又称为多酚氧化酶，是一种单加氧酶，其兼具单酚酶和二酚酶活性。作为一种重要的生物资源，酪氨酸酶在有机合成领域、环境工程领域、生物传感器以及食品领域有着广泛的应用。里氏木霉(trichoderma reesei)具有强大的蛋白质合成和分泌能力，是美国食品药品监督管理局认定为安全菌株，其生产的蛋白可用于食品、酿酒等行业，是蛋白表达的优良宿主。
3.目前，研究最广泛的真菌酪氨酸酶来自于双孢蘑菇，丝状真菌里氏木霉的酪氨酸酶2相关报道较少，国内还未实现里氏木霉来源的酪氨酸酶2的超量表达。酪氨酸酶2在里氏木霉的超量表达是研究里氏木霉酪氨酸酶2性质和结构的基础，也是酪氨酸酶2发挥更大应用价值的必须步骤。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提出了一种高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株的构建方法和应用，实现酪氨酸酶2在里氏木霉中的超量表达，为酪氨酸酶2性质和结构的研究提供奠定基础。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
6.一种高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
7.步骤1，酪氨酸酶2表达载体的构建：
8.s11，pcr扩增tyr和cbh1启动子
9.人工合成酪氨酸酶2基因片段tyr，并以带有tyr的质粒为模板，pcr扩增酪氨酸酶2基因片段tyr；所述酪氨酸酶2基因片段tyr的核苷酸序列如genbank登录号：ki911141.1所示；
10.pcr扩增cbh1启动子；
11.s12，构建重组质粒ptrcbh1-tyr
12.使用sbfi和xbai两种限制性内切酶对质粒进行双酶切，用无缝克隆试剂盒将酶切后的载体片段、tyr片段和cbh1片段进行连接，形成重组质粒ptrcbh1-tyr；
13.步骤2，里氏木霉重组菌株的制备：
14.s21，重组质粒在大肠杆菌中的大量复制
15.取大肠杆菌感受态细胞，吸取感受态细胞与步骤1获得的重组质粒ptrcbh1-tyr混合，加入培养基进行复苏培养，之后取适量菌液涂布于含有氨苄青霉素的lb平板，培养后挑取单菌落，鉴定重组子，提取获得重组质粒ptrcbh1-tyr；
16.s22，制备里氏木霉感受态分生孢子
17.取培养若干天的里氏木霉，用无菌水洗取里氏木霉孢子，接种在培养基中进行萌发，将获得的培养液离心、弃上清液，用d-山梨醇重悬，而后重复离心、弃上清液、d-山梨醇重悬处理1～3次，最终获得里氏木霉感受态分生孢子；
18.s23，扩增酪氨酸酶2表达盒
19.以s21获得的重组质粒ptrcbh1-tyr为模板，pcr扩增酪氨酸酶2表达盒；
20.s24，表达盒电转化里氏木霉
21.取s22制备获得的里氏木霉感受态分生孢子，加入s23中扩增得到的酪氨酸酶2表达盒dna，获得的混合物经电击处理后，加入d-山梨醇和ypd培养基、培养后，取悬浮物涂布在含有潮霉素b的pda平板，继续培养后筛选获得里氏木霉重组子；
22.s25，重组里氏木霉的鉴定
23.挑选多个s24中筛选得到的里氏木霉重组子，在酪氨酸酶显色平板上培养，能够在显色平板显棕色的则为阳性转化子，即可作为目的重组菌株——高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株。
24.进一步的，步骤1中s11扩增酪氨酸酶2基因片段tyr的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
25.进一步的，步骤1中s11扩增cbh1启动子的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
26.本发明的第二方面提供了由前述第一方面所述方法构建得到的高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株。
27.本发明的第三方面提供了前述第二方面所述里氏木霉工程菌株在制备酪氨酸酶2中的应用，培养所述的里氏木霉工程菌株，发酵培养制备得到酪氨酸酶2。
28.本发明相比现有技术的有益效果为：
29.本发明利用无缝克隆技术，将酪氨酸酶2基因构建到大肠杆菌-里氏木霉穿梭质粒载体上，获得的重组质粒采用热击法转化大肠杆菌感受态细胞，在大肠杆菌内大量复制，提取重组质粒，然后扩增酪氨酸酶2基因表达盒，通过电穿孔方法转化里氏木霉得到重组菌株；本发明构建得到的里氏木霉重组菌株经摇瓶发酵，可高产酪氨酸酶2，为酪氨酸酶2性质和结构的研究提供奠定基础，并可代替从双孢蘑菇中提取酪氨酸酶的方法，用于工业化生产。
30.本发明的其它特征和优点将通过随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
31.图1为本发明实施例1构建获得的所述重组质粒ptrcbh1-tyr的图谱；
32.图2为本发明实施例1所述方法步骤2中s25显色平板筛选得到各组阳性转化子的图片；
33.图3为本发明实施例2中利用sds-page检测发酵上清中酪氨酸酶2的表达结果示意图；
34.图4为本发明实施例2中酪氨酸酶2的蛋白交联结果示意图；其中，a为酪氨酸酶2和大豆球蛋白的交联，b为酪氨酸酶2和玉米醇溶蛋白的交联。
具体实施方式
35.在本文所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围被视为在本文中具体公开。
36.以下将通过具体实施例对本发明进行详细描述。
37.以下实施例中，在没有特别说明的情况下，涉及到的实验仪器和原料均为市售品。
38.实验仪器，见表1。
39.表1实验仪器表
[0040][0041]
原料，见表2。
[0042]
表2原料表
[0043][0044]
以下实施例中，涉及到的性能的测试方法如下：
[0045]
1、酪氨酸酶酶活测定
[0046]
在比色皿中配制如下反应体系：1.7ml0.1m磷酸二氢钠缓冲液(ph 7.0)+1ml2mg/
ml l-多巴(用磷酸二氢钠缓冲液稀释)+300μl发酵上清液，每隔30s读取od
475
，共读取3min，每组3次重复。一个酶活性单位被定义为每分钟催化氧化1μmol l-多巴的酶的量。酪氨酸酶酶活计算公式如下：
[0047][0048]
式中：δod为吸光度的变化值；v1为酶反应中反应液的总体积(ml)；n为酶液稀释倍数；δt为酶反应时间；ε
475
(l-多巴)为3600(m-1
cm-1
)；v2为酶反应中酶液的体积(ml)。
[0049]
2、重组酪氨酸酶2的蛋白交联实验
[0050]
分别将0.2g的玉米醇溶蛋白溶解在20ml50mmtris hcl(ph＝9)中在4℃下搅拌过夜，0.2g大豆球蛋白溶解在20ml100mm磷酸钠缓冲液(ph＝7.4)中室温搅拌30min，然后加入发酵上清液(100u/ml)，加入无菌水作为对照组，反应混合物在摇床(30℃，200rpm)孵育，分别于0、0.5、1、2、3、4h取样，加入蛋白上样缓冲液终止反应，所有样品进行sds-page电泳分析(配制12％分离胶，5％浓缩胶)。
[0051]
实施例1——高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株的构建
[0052]
本实施例提供了一种高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0053]
步骤1，酪氨酸酶2表达载体的构建：
[0054]
s11，pcr扩增酪氨酸酶2基因片段tyr和纤维二糖水解酶1启动子cbh1
[0055]
人工合成酪氨酸酶2基因片段tyr，并以带有tyr的puc57质粒为模板，设计特异性引物、pcr扩增酪氨酸酶2基因片段tyr；所述酪氨酸酶2基因片段tyr的核苷酸序列如genbank登录号：ki911141.1所示。所述特异性引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示：
[0056]
上游引物：5
’‑
aaatgctgttgtcagcgtccct-3’；
[0057]
下游引物：5
’‑
ccggtcacgaaagcctctagattacagaggagggatatgggga-3’。
[0058]
pcr程序如下：
[0059]
98℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，72℃终延伸5min，共30个循环。
[0060]
cbh1启动子是在里氏木霉进行蛋白表达时最常用的强启动子，本实施例设计特异性引物以质粒ptrcbh1-sblg为模板，pcr扩增cbh1启动子片段。所述特异性引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示：
[0061]
上游引物：5'-gcgaatgcgtcgagacctgcaggcaaacaaagaacgaagacgcc-3'；
[0062]
下游引物：5'-ggacgctgacaacagcatttaattaagatgcgcagtccgc-3'。
[0063]
pcr程序如下：
[0064]
98℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃终延伸5min，共30个循环。
[0065]
s12，构建重组质粒ptrcbh1-tyr
[0066]
使用sbfi和xbai两种限制性内切酶对质粒进行双酶切(37℃，4h)，用无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞公司，c115)将酶切后的质粒载体片段、tyr片段和cbh1片段进行连接，形成重组质粒ptrcbh1-tyr，具体如图1所示。
[0067]
步骤2，里氏木霉重组菌株的制备：
[0068]
s21，重组质粒在大肠杆菌中的大量复制
[0069]
取大肠杆菌top 10感受态细胞，冰上融化，吸取40μl感受态细胞与4μl步骤1获得的重组质粒ptrcbh1-tyr混合，冰浴30min，42℃热击90s，立即冰浴2min，加入1ml新鲜lb培养基，37℃复苏培养1.5h，之后取适量菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb平板，培养24h后挑取单菌落，鉴定重组子，提取获得重组质粒ptrcbh1-tyr。
[0070]
s22，制备里氏木霉感受态分生孢子
[0071]
取培养10天的里氏木霉平板，用无菌水洗取里氏木霉孢子，接种100ml ypd在培养基中进行萌发4h(30℃，250rpm)，将获得的培养液离心(2230
×
g，4℃，5min)，弃上清液后，每管用25ml预冷的1.1md-山梨醇重悬，离心(2230
×
g，4℃，5min)，弃上清液后，每管用150μl预冷的1.1m山梨醇重悬，每75μl的里氏木霉感受态分生孢子分装在1.5ml离心管。
[0072]
s23，扩增酪氨酸酶2表达盒
[0073]
利用通用引物m13/puc(北京擎科生物公司)，以s21获得的重组质粒ptrcbh1-tyr为模板，pcr扩增酪氨酸酶2表达盒。pcr程序如下：
[0074]
98℃预变性2min，98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3.5min，72℃终延伸5min，共30个循环。
[0075]
s24，表达盒电转化里氏木霉
[0076]
取75μl上述s22制备获得的里氏木霉感受态分生孢子，加入6～10μl上述s23中扩增得到的酪氨酸酶2表达盒dna，获得的混合物、并在冰上孵育30分钟后，将混合物转移到2mm无菌电转杯中电击，将电转杯中的混合物转移至1.5ml离心管中，加入400μl预冷的1.1m山梨醇和125μl的ypd培养基(预混)，然后将混合物在30℃，150rpm培养1h，取150μl培养后得到的悬浮物涂布在含有潮霉素b(5μg/ml)的pda平板，继续30℃培养3天后，筛选获得里氏木霉重组子。
[0077]
s25，重组里氏木霉的鉴定
[0078]
挑选多个上述s24中筛选得到的里氏木霉重组子，在酪氨酸酶显色平板上培养2～3天，能够在显色平板显棕色的则为阳性转化子，即可作为目的重组菌株——高产酪氨酸酶2的里氏木霉工程菌株。
[0079]
s25中显色平板上培养使用的培养基是在基础培养中进行的改进，具体成分组成为：
[0080]
20g乳糖，10g kh2po4，5g(nh4)2so4，1g mgso4·
7h2o，0.5g cacl2，1.8g caco3，10g邻苯二甲酸氢钾，10g l-酪氨酸，0.5gcuso4·
5h2o，0.2g tween 80，0.005g feso4·
7h2o，0.0016g mnso4·
h2o，0.0014gznso4·
7h2o，0.0037g cocl2·
6h2o，调节ph至6，定容至1l。
[0081]
如图2所示的12个平板上，1-7号均为可以分泌酪氨酸酶2的阳性转化子，选择其中显色最深的3号转化子作为目的重组菌株进一步研究。
[0082]
实施例2——重组菌株发酵培养制备得到酪氨酸酶2
[0083]
利用实施例1构建的3号重组里氏木霉工程菌株，进行摇瓶发酵培养、制备得到酪氨酸酶2，所述发酵培养的步骤如下：
[0084]
将1ml里氏木霉工程菌株的重组菌株孢子液(107个/ml)接种至装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，180rpm，30℃培养48h，取5ml种子培养液接种至有50ml发酵培养基的
250ml三角瓶中，180rpm，30℃培养7d。
[0085]
所述种子培养基成分：
[0086]
20g葡萄糖，9g玉米浆，10g kh2po4，5g(nh4)2so4，1g mgso4·
7h2o，0.5g cacl2，0.005g feso4·
7h2o，0.0016g mnso4·
h2o，0.0014g znso4·
7h2o，0.0037cocl2·
6h2o，定容至1l，调节ph至4.8。
[0087]
所述发酵培养基成分：
[0088]
18g乳糖，20g微晶纤维素，12g玉米浆，10g kh2po4，5g(nh4)2so4，1g mgso4·
7h2o，0.5g cacl2，1.8g caco3，2g麦麸粉，0.5g cuso4·
5h2o，0.2g tween 80，0.005g feso4·
7h2o，0.0016g mnso4·
h2o，0.0014gznso4·
7h2o，0.0037cocl2·
6h2o，定容至1l，调节ph至4.8。
[0089]
经过测定，重组菌株摇瓶培养7天后的发酵上清液中，酪氨酸酶2的酶活可达到1415u/ml，酪氨酸酶2的浓度约为2.16g/l，高于目前公开发表的研究中的最高浓度：1g/l。
[0090]
利用sds-page检测(12％分离胶，5％浓缩胶)发酵上清液中酪氨酸酶2的表达情况。结果见图3，与野生里氏木霉相比，重组菌株培养1-7天的发酵上清在43.2kda附近能观察到酪氨酸酶2的表达。
[0091]
进而检测获得的酪氨酸酶2的蛋白交联情况。蛋白交联结果见图4，与不添加本实施例摇瓶培养3号重组里氏木霉工程菌株获得发酵上清液(即酪氨酸酶2粗酶液)的蛋白溶液相比，酪氨酸酶2粗酶液和大豆球蛋白、玉米醇溶蛋白在实验条件下交联0.5h即可在浓缩胶胶孔和分离胶顶部观察到大分子交联蛋白的出现。本实施例发酵获得的重组酪氨酸酶2和大豆球蛋白、玉米醇溶蛋白的交联，说明重组酪氨酸酶2在蛋白交联应用领域具有一定潜力，或可代替由蘑菇提纯制备的商业酪氨酸酶在交联食品体系发挥作用。