与LMH细胞免疫应答相关的蛋白质pX及其相关生物材料和应用的制作方法

本技术具体涉及与lmh细胞免疫应答相关的蛋白质px及其相关生物材料和应用。

背景技术：

1、禽腺病毒可感染鸡、鹅、鸭和野鸟物种。禽腺病毒4型通常感染幼龄鸡，尤其是5周龄以下的肉鸡，可引起感染鸡心包积水综合征(hydropericardium syndrome，hhs)，其临床特征是心包内有透明的或草莓色的积液，肺水肿，肝脏肿胀变色，肾脏膨胀，伴有局灶性坏死和点状出血，近年来，fadv4在鸡群中多次暴发，给相关方造成严重的经济损失。感染后发病严重，死亡率高达80％，对养殖业造成严重威胁。

2、禽腺病毒为无囊膜双链dna病毒，病毒粒子直径70～90nm，正二十面体结构，每个病毒粒子由252个衣壳粒组成。其中hexon、peton、fiber是衣壳的主要结构蛋白，核衣壳蛋白还包括px、pⅵ、pⅶ、pvⅲ。腺病毒非结构蛋白主由e1a、e1b、e3、e4、100k、52/55k等。hexon蛋白具有中和表面抗原功能，作为血清分型的主要蛋白。penton蛋白可以与细胞内其他蛋白结合，在病毒进入细胞发挥重要作用。fiber蛋白包括长纤突蛋白(fiber-1)和短纤突蛋白(fiber-2)，fiber-2蛋白具有良好的抗原性，可诱导和抗体，有效抵抗腺病毒感染。禽腺病毒进入细胞后，px蛋白发挥的作用不明确，研究发现，人腺病毒蛋白x(px)，可调节e2蛋白的表达，在病毒复制过程中参与将线性双链dna基因组带到衣壳，但鸡腺病毒px的作用在很大程度上尚不清楚。

技术实现思路

1、本身请提供了与lmh细胞免疫应答相关的蛋白质px及其相关生物材料和应用。

2、为了解决上述问题，本技术提供了下述应用。

3、蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种应用：

4、所述应用为下述任一种：

5、a1)用于提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中toll样受体基因转录水平；

6、a2)用于制备提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中toll样受体基因转录水平的产品、；

7、a3)用于提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中免疫效应因子基因转录水平；

8、a4)用于制备提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中免疫效应因子基因转录水平的产品；

9、所述蛋白质为如下述任一项：

10、b1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

11、b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具上调或增强或提高鸟纲动物toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的蛋白质；

12、b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

13、序列2的氨基酸序列如下所示：

14、mpavlltggraaskrkfstkqrrkkavsvpkirsrsgkrsgvrkrssisvpvsgtasaseraalqnlaqrlqrgn ytawrsadpsvaaseaakaaaasgaaayvrdlttgtaaeavpltgtgrrrrtgarrsmrggffpalipliaaaigaipgi agtavgiaslkeqqrqfnklygnk。

15、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

16、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

17、上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

18、上述蛋白质中，序列2(seq id no.2)由个179个氨基酸残基组成

19、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

20、上述的应用中，所述toll样受体基因课为chtlr1b、chtlr2a、chtlr3、chtlr7和chtlr15中的一种或多种；

21、和/或；

22、免疫效应因子为干扰素和白介素的一种或多种。

23、上文中，所述干扰素可为ifn-α和ifn-β的一种或多种。

24、上文中，所述白介素可为il-6、il-8、il-15和il-1β的一种或多种。

25、上述应用，所述蛋白质可来源于禽腺病毒。

26、
技术实现要素：

27、上文中，所述禽腺病毒可为4型禽腺病毒，4型禽腺病毒简称fadv-4。所述蛋白质简称px蛋白或蛋白px。

28、本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述被基因的编码蛋白质可为下述任一种：

29、c1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

30、c2)将c1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具上调或增强或提高鸟纲动物toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的蛋白质。

31、为了解决上述问题，本技术提供了下述任一种的应用。

32、相关生物材料在下述任一种的应用；

33、所述生物材料为下述任一种：

34、d1)、编码上述任一所述蛋白质的核酸分子；

35、d2)、含有d1)所述核酸分子的表达盒；

36、d3)、含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；

37、d4)、含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；

38、d5)、含有d1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有d2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有d3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

39、d6)、含有d1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因动物组织、或含有d3)所述重组载体的转基因动物组织；

40、d7)、含有d1)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因动物器官、或含有d3)所述重组载体的转基因动物器官；

41、所述应用为下述任一种：

42、a1)生物材料在提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中toll样受体基因转录水平中的应用；

43、a2)生物材料在制备提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中toll样受体基因转录水平的产品中的应用；

44、a3)生物材料在提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中免疫效应因子基因转录水平中的应用；

45、a4)生物材料在制备提高鸟纲动物细胞和/或鸟纲动物组织和/或鸟纲动物中免疫效应因子基因转录水平的产品中的应用。

46、上文中，所述上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质可为上述d1)编码上述任一所述蛋白质的核酸分子、d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒或d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体或含有d2)所述表达盒的重组载体。

47、d1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质px的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质px的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质px且具有蛋白质px功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

48、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

49、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

50、上述生物材料中，d1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。d1)所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列1所示的dna分子。

51、序列1的核苷酸序列如下所示：

52、atgcccgccgtgcttttgaccgggggtcgcgccgcctccaagcgtaaattcagcaccaagcagcgtcgcaagaaagcggtgtccgtgcccaagattcgctcgcgcagcggcaagcgcagcggcgttcggaagcgttcgtccatttcggtgcccgtgagcggcacggccagcgcctcggagagagctgccttgcaaaatctggcgcaacgccttcagaggggcaactacacggcctggcgctcggcggacccctcggtcgccgcgagcgaagctgccaaggcggccgccgccagcggcgccgcggcctacgtgcgagacctgactacgggcaccgcggccgaggcggtcccgctcaccggcaccgggaggcggcgtcgcaccggggcgaggcgatcgatgcgcggtggctttttcccggctctgattcctctgatcgccgccgccatcggcgccatccccggcatcgccggcaccgccgtgggcatcgcgagccttaaggaacagcagagacaattcaataagttgtatggcaacaagtga。

53、上述生物材料中，d2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述启动子可为pef1α(human elongation factor 1alphapromoter)，简称人延伸因子1α启动子。

54、上述d3)中，可用动物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。具体可为pef1α-ha vector。

55、也可为含有所述核酸分子或含有核酸分子的表达盒克隆载体。载体可为pmd18-t。上述d4)所述的微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为dh5α。

56、上述d5)所述转基因动物组织或上述d6)所述的转基因动物器官可由d5)所述动物细胞系经生物学手段制备而得。

57、上述应用中，d5)-d7所述的动物细胞可为下述任一种：

58、e1)鸟纲动物细胞

59、e2)鸡形目动物细胞；

60、e3)雉科动物细胞；

61、e4)原鸡属动物细胞。

62、上文中，d5)-d7所述的动物细胞可为鸡肝癌细胞，简称lmh细胞。

63、上述的应用中，所述上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质可为上述的生物材料。

64、为了解决上述问题，本技术提供了一种提高鸟纲动物细胞基因转录的方法。

65、本技术所提供的提高鸟纲动物细胞基因转录的方法，包括上调或增强或提高目的鸟纲动物细胞中上述任一所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量来上调或增强或提高鸟纲动物细胞中toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录。

66、上文中，所述基因转录为toll样受体基因和/或免疫效应因子基因的转录。具体种类如上所述。

67、为了解决上述问题，本技术提供了制备高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物细胞的方法。

68、所述制备高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物细胞的方法包括上调或增强或提高目的鸟纲动物细胞中上述任一所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的活性和/或含量，得到高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物细胞，所述高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物细胞中的toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平高于所述目的鸟纲动物细胞。

69、上述的方法中，所述上调或增强或提高目的植物中上述任一所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的活性或含量为将上述的生物材料导入所述目的鸟纲动物细胞。

70、上文中，所述生物材料为如下所述：

71、d1)、编码上述蛋白质的核酸分子。

72、d2)、含有d1)所述核酸分子的表达盒。

73、d3)、含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体。所述重组载体可如上所述，具体可为pef1α-ha vector。

74、上文中，所述导入可通过脂质体转染技术来实现。具体可为：

75、d10)、含有d1)所述核酸分子的重组载体的人工生物膜、或含有d2)所述表达盒的重组载体的人工生物膜。

76、人工生物膜又称脂质体，是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层。可用于脂质体转染技术。

77、编码上述蛋白质的核酸分子可为：

78、e1)、核酸序列是序列1所示的dna；

79、e2)、将e1)所述dna的经过核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与e1)所示的dna具有80％以上的同一性且具上调或增强或提高鸟纲动物toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的dna。

80、为了解决上述问题，本技术提供了鸟纲动物组织和/或鸟纲动物器官和/或鸟纲动物的培育方法。

81、本身请提供的鸟纲动物组织和/或鸟纲动物器官和/或鸟纲动物的培育方法包括利用上述的方法制备高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物细胞，再用所述高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物细胞培育高toll样受体基因和/或免疫效应因子基因转录水平的鸟纲动物组织和/或鸟纲动物器官和/或鸟纲动物。

82、本技术中，所述的应用、方法中，所述鸟纲动物细胞可为下述任一种：

83、r1)鸡形目；

84、r2)雉科；

85、r3)原鸡属；

86、r4)鸡肝癌细胞。

87、所述鸡肝癌细胞可为lmh细胞。

88、本课题组前期研究中发现fadv-4强毒株感染lmh细胞和spf鸡后，toll样受体及效应因子mrna转录水平发生显著变化，提示fadv-4感染与宿主的天然免疫模式受体识别及其效应因子产生密切相关。但是，fadv-4px基因是否参与调控宿主的天然免疫作用不明确，需要进一步研究。本试验以fadv-4px基因为研究对象，构建pef1α-ha-px重组表达质粒，转染lmh细胞，利用实时荧光定量pcr检测10种toll样受体及6种效应因子mrna转录水平，分析探讨fadv-4px基因和宿主天然免疫之间的相互作用。为进一步阐释fadv-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。

89、有益效果

90、本发明公开了与lmh细胞免疫应答相关的蛋白质px及其相关生物材料和应用。本技术构建了蛋白质px编码基因的过表达载体pef1α-ha-px。将过表达载体转入lmh细胞中，获得转染pef1α-ha-px的lmh细胞，经过检测发现，以转染pef1α-ha的lmh细胞为对照，转染pef1α-ha-px的lmh细胞中px蛋白含量明升高。且转染pef1α-ha-px的lmh细胞中chtlr1b、chtlr2a、chtlr3、chtlr7、chtlr15、chtlr2a、ifn-α、ifn-β、il-6、il-8、il-15和il-1β基因的转录水平明显升高。结果显示px蛋白在lmh细胞中表达式激活了lmh细胞免疫应答。转染pef1α-ha-px的lmh细胞可以用于lmh细胞对fadv-4入侵应答机制的研究。