一种调控番茄生长发育的基因及敲除方法和应用

1.本发明涉及一种调控番茄生长发育的基因及敲除方法和应用，属于基因领域。


背景技术：

2.番茄(solanum lycopersicum)是世界范围内栽培最广、消费量最大的蔬菜作物，原产于南美洲，由于其良好的口感、富含多种维生素且可以生食、炒食、生产番茄酱等多方面的食用方式而被人们喜爱，在中国南北方广泛种植。番茄生长周期通常为3至5个月，全体生粘质腺毛，有强烈气味，茎易倒伏，叶羽状复叶或羽状深裂，常3-7朵花，花萼辐状，花冠辐状，浆果扁球状或近球状，肉质而多汁液，种子呈黄色。番茄在全球蔬菜生产与消费中占有重要地位，提高番茄产量能够带来较高的经济价值。为了提高产量，菜农通常需要浪费过多的土地以及施加更多的肥料，这对土地资源及生态环境带来了极大的不利因素。因此，如何更加高效提高番茄的产量成为了亟待解决的问题。
3.pho2基因是在拟南芥中发现的一个与磷营养吸收调控相关的基因，其能够抑制拟南芥中的磷转运蛋白pt1的表达，从而抑制植物对磷的吸收。pho2基因在拟南芥中被敲除后，会增加拟南芥对磷营养的吸收能力，进而对植物生长发育会产生影响。前人的研究还发现pho2基因被突变后不仅会促进植物叶片中气孔的发育，还能够增加植物对病原菌的抗性。pho2基因在被子植物中广泛存在，除了在拟南芥中存在以外，还存在于玉米、水稻、柑橘等植物中。
4.本研究利用本实验室构建的基于crispr/cas9技术构建番茄的pho2基因敲除载体，产生pho2基因突变体番茄植株，发现在pho2基因敲除番茄植株中出现了生长周期由野生型中4至5个月延长至14个月以上，并在此过程中，植株具有持续产生新的分枝的能力并呈现出多轮的开花和结果的表型。说明对番茄pho2基因的敲除延长了番茄的生长周期，并由此增加了番茄的果实的产量。


技术实现要素：

5.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种延长番茄生长周期并保持持续的开花结果能力的调控番茄生长发育的基因及敲除方法和应用。
6.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种调控番茄生长发育的基因，它的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.一种调控番茄生长发育的基因的编码蛋白，它的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.一种重组表达载体，包括调控番茄生长发育的基因。
10.一种转化子，包括重组表达载体的宿主细胞。
11.优选的：它的宿主为微生物、植物或转基因细胞系。
12.一种调控番茄生长发育的基因的敲除方法，包括以下步骤：
13.步骤1，对番茄pho2基因的cds区进行grna设计，选取位于起始密码子下游500bp以内、on-target分值高且脱靶率低的grna，合成其正反链的单链dna序列。
14.步骤2，合成spacer：将合成的两条单链进行pcr得到双链产物spacer。
15.步骤3，将spacer与atu6-26v4载体连接：使用bbs1-hf内切酶对atu6-26v4质粒进行酶切，用t4连接酶将spacer与酶切后的atu6-26v4质粒连接。将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α，并在氨苄霉素抗性培养基中筛选单克隆进行摇菌，提取质粒后使用
‘
中间载体检测-f’引物进行sanger测序，经过测序验证spacer与atu6-26v4载体连接成功的质粒即为中间载体。将中间载体作为pcr底物，设计带有同源臂的引物
‘
soso-f’和
‘
soso-r’，进行pcr扩增grna scaffold_spacer区域。
16.步骤4，将grna scaffold_spacer序列与pcc载体连接：使用ecor1内切酶对pcc质粒进行酶切，使用in-fusion hd cloning kit将grna scaffold_spacer序列与pcc载体进行重组连接。将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α，并在盐酸壮观霉素抗性培养基中筛选单克隆进行摇菌，提取质粒后使用
‘
最终载体检测-f’引物进行sanger测序。对经过测序验证grna scaffold_spacer与pcc载体连接成功的质粒即为crispr/cas9最终载体。
17.优选的：步骤2中两条中的一条单链dna序列grna1-f如下：caccggggtcttcgactaaatcag，grna1-r如下：aaacctgatttagtcgaagacccc。
18.步骤2中两条中的另一条单链dna序列grna2-f如下：gattgttggggattatgtagtgat，grna2-r如下：aaacatcactacataatccccaac。
19.优选的：步骤3中的中间载体检测-f引物如下：gagctcggatccactagtaa。
20.soso-f引物如下：tatgacatgattacgaattcgagctcggatccactagtaa。
21.soso-r引物如下：ctaatctggggaccgaattcgtgtgatggatatctgcaga。
22.优选的：步骤4中最终载体检测-f引物如下：atgcttccggctcgtatgtt。
23.一种调控番茄生长发育的基因的应用，用于调节番茄生长周期。
24.本发明相比现有技术，具有以下有益效果：
25.本发明通过以番茄“microtom”品种为研究对象，构建了基于crispr/cas9技术的番茄pho2基因敲除载体，通过对两个突变株系的表型鉴定，发现该基因的敲除会导致番茄分生能力增强，延长番茄生长周期，并保持持续的开花结果能力；该基因的cds序列如seq id no.1所示，该发明可以为促进番茄生长发育、提高果实产量提供巨大帮助。
附图说明
26.附图1基于crispr/cas9技术的番茄pho2基因敲除载体构建流程.
27.附图2crispr中间载体atu6-26v4载体.
28.附图3pcc载体图谱.
29.附图4番茄pho2突变体植株生长14个月后仍保持开花结果的表型。图4中图a:野生型番茄在5个月时进入生长末期；图4中图b：pho2基因突变体番茄在14个月后仍表现出生长旺盛、并保持持续的开花结果能力。
具体实施方式
30.下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
31.实施例1：基于crispr/cas9技术构建pho2基因敲除载体
32.通过benchling(https://www.benchling.com/crispr)在线服务工具针对番茄pho2基因的cds区进行grna(guide rna)的设计。选取位于起始密码子下游500bp以内、on-target分值高且脱靶率低的grna，合成其正反链的单链dna序列(附表1)。
33.表1crispr/cas9载体构建所需引物
[0034][0035]
基于crispr/cas9技术构建pho2基因敲除载体按照如下步骤进行构建(如图1所示)：
[0036]
1)合成spacer：将合成的两条单链(如grna1-f和grna1-r，引物序列见表1)各取12.5μl混合，置于pcr仪中，经95℃加热3min、16℃退火5min，得到双链产物spacer；
[0037]
2)将spacer与atu6-26v4载体连接：使用bbs1-hf内切酶对atu6-26v4质粒进行酶切，用t4连接酶将spacer与酶切后的atu6-26v4质粒连接。将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α，并在氨苄霉素抗性培养基中筛选单克隆进行摇菌，提取质粒后使用
‘
中间载体检测-f’引物(附表1)进行sanger测序，经过测序验证spacer与atu6-26v4载体(如图2所示)连接成功的质粒即为中间载体。将中间载体作为pcr底物，设计带有同源臂的引物(
‘
soso-f’和
‘
soso-r’，引物序列见附表1)进行pcr扩增grna scaffold_spacer区域。
[0038]
3)将grna scaffold_spacer序列与pcc载体(已连有cas9表达元件pchf1载体)连接：使用ecor1内切酶对pcc质粒进行酶切，使用in-fusion hd cloning kit将grna scaffold_spacer序列与pcc载体进行重组连接。将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α，并在盐酸壮观霉素抗性培养基中筛选单克隆进行摇菌，提取质粒后使用
‘
最终载体检测-f’引物(附表1)进行sanger测序。对经过测序验证grna scaffold_spacer与pcc载体连接成功的质粒即为crispr/cas9最终载体(如图3所示)。
[0039]
4)将最终载体转入农杆菌：构建好的基于crispr/cas9技术的番茄pho2基因敲除载体转入农杆菌感受态gv3101。使用带盐酸壮观霉素抗性和利福平抗性的培养基筛选阳性
菌株，经过pcr扩增、跑胶，筛选具有单一条带的农杆菌用于后续侵染实验。
[0040]
一种调控番茄生长发育的基因的编码蛋白，它的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0041]
seq id no.1(pho2基因cds序列，长2778bp)：
[0042]
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[0074]
一种调控番茄生长发育的基因，它的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0075]
seq id no.2(pho2基因序列，长5064bp)：
[0076]
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[0160]
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[0161]
实施例2：pho2基因突变番茄植株的构建
[0162]
1)种子萌发
[0163]
在超净台中将野生型番茄(
‘
microtom’品种)种子置于10％的次氯酸钠溶液中反复摇晃消毒8分钟；再用无菌水反复摇晃清洗3次，每次5分钟；将种子均匀置于萌发培养基的无菌培养瓶中发芽。将培养瓶放在光照培养架上，设置光照16小时，黑暗8小时，8
–
12天即可长出子叶。
[0164]
2)子叶预培养
[0165]
待番茄子叶完全长出，且真叶还未长出时，在超净台中将剪去叶尖和叶尾的子叶用镊子轻轻置于预培养基上，使子叶正面朝上且尽量让切口接触培养基，在光照培养基上培养2
–
3天。
[0166]
3)农杆菌侵染预培养子叶
[0167]
在超净台中将基于crispr/cas9技术的番茄pho2基因敲除载体的农杆菌菌液200μl，吸打到含有盐酸壮观霉素和利福平抗性的20ml lb培养基中，置于28℃、200rpm摇床中进行培养。待od值达到0.4
–
0.6时，将菌液5000rpm离心10min，弃上清后，加入同体积侵染液，并重悬菌液。
[0168]
将预培养处理的子叶放入重悬的菌液中，用锡箔纸包裹避光，并手动轻柔摇晃10min，使子叶充分与菌液结合。摇晃结束后将子叶转移至无菌滤纸上，吸干子叶表面液体，最后将子叶正面朝上置于诱导培养基中避光共培养1天。
[0169]
4)番茄筛选分化
[0170]
避光共培养1天后，将子叶转移至筛选培养基上，每15
–
20天更换一次培养基，将已长出叶子的外植体转移到含有筛选培养基的培养瓶中继续培养。
[0171]
5)突变体类型和过表达植株鉴定
[0172]
针对突变体类型检测，首先剪取外植体上大小约0.4cm
×
0.4cm的叶片，使用plant tissue pcr kit提取dna，并以提取的dna作为模板，用特异性引物扩增grna靶标序列上下游各300bp左右的区域(附表1)，扩增产物进行sanger测序。使用dsdecode(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)在线分析网站对测序文件进行解析。与参考基因组比较，当目的基因含有非3倍数的碱基插入缺失，或者碱基突变/插入缺失引入翻译提前终止的密码子时，则保留该外植体用于后续培养。
[0173]
6)阳性苗继续培养
[0174]
将长出3至4片叶子的外植体转移至含有生茎培养基的培养瓶中，当长出较为明显的茎时，应当使用无菌剪刀将发育出明显叶片和茎杆的番茄苗切出，并转移到生根培养基中，诱导其生根，当番茄植株长出2至3条根后，将其转移到营养土中培养繁代。对于突变体植株，当番茄植株壮硕后，再次提取dna对突变体类型进行检测，保证获得植株为阳性突变体。
[0175]
7)敲除植株表型观测
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将筛选后的纯合株系按照上诉萌发方式进行无菌苗的萌发，在萌发后放入种植盆中进行培养，并定期观察、记录植株的表型，并与野生型番茄植株进行对比(如图4所示)。pho2基因突变体番茄在14个月后仍表现出生长旺盛、并保持持续的开花结果能力。
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本发明所述基因pho2基因在番茄生长周期并保持持续的开花结果能力的应用。本发明针对番茄中pho2基因设计crispr/cas9 guiderna并利用pcc载体构建敲除载体，利用组培和农杆菌侵染得到pho2基因的敲除植株，通过sanger法基因测序鉴定pho2基因被敲除；通过14个月内不断对pho2基因敲除植株表型的观察和记录，证实pho2基因的敲除可以延长番茄生长周期并保持持续的开花结果能力，该基因敲除植株的长时间开花结果表型为番茄中首次报道。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。