一种抑制CCR4基因表达的siRNA及其应用

一种抑制ccr4基因表达的sirna及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种特异性抑制ccr4基因表达的sirna及其应用。


背景技术：

2.肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，是呼吸病四大病种之一，是肺部最为严重的一种病理状态。其病理改变大多表现为最初的下呼吸道炎症，以及肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，伴有成纤维母细胞和ii型肺泡细胞增殖、细胞因子释放，细胞外基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺部改变。肺纤维化患者肺部肺泡逐渐被纤维性物质取代，导致肺组织变硬变厚，肺脏气体交换能力逐步丧失，导致患者不同程度缺氧而出现呼吸困难，最后因呼吸衰竭而死亡。肺纤维化病因复杂，发病机制不明，目前已有的治疗肺纤维化的药物和方法十分有限，且疗效差强人意，预后极差，5年生存率仅为50％。
3.ccr4是趋化因子ccl17的唯一已知受体。ccl17-ccr4轴在免疫疾病的发病中起着至关重要的作用。据报道，ccl17-ccr4轴与多种炎症性疾病有关，包括皮炎、过敏性哮喘、动脉粥样硬化、结肠炎和关节炎。近年来，ccl17-ccr4轴已被证明在纤维化疾病的发病机制中发挥重要作用。
4.本发明前期结果显示，肺纤维化患者和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺中ccl17水平升高，特别是肺泡巨噬细胞中ccl17表达上调。机制研究显示，ccl17与其受体ccr4在成纤维细胞上相互作用，从而激活tgf-β/smad信号通路，促进成纤维细胞活化和组织纤维化。这些结果提示ccl17-ccr4轴参与肺纤维化的进展，靶向ccr4可抑制成纤维细胞激活和组织纤维化，抑制ccr4是治疗肺纤维化的一个潜在靶点。因此，研究和开发抑制ccr4表达的物质，具有很好的治疗肺纤维化的成药前景。


技术实现要素：

5.因为肺纤维化发病机制复杂，所以目前缺乏有效的治疗药物，本发明的目的是提供一种抗纤维化的rna干扰药物，采用rnai技术，在mrna水平降低ccr4基因的表达，进而抑制成纤维细胞活化产生过度细胞外基质，有效治疗肺纤维化。
6.sirna序列可以通过直接的化学合成、体外转录、质粒扩增、病毒复制等方式获得，因此本发明应包括包含所述序列的前述应用形式。
7.为解决本发明的技术问题，本发明提供下述的技术方案。
8.本发明首要目的是提供一种能与ccr4mrna特异性结合靶向降低ccr4表达，从而抑制成纤维细胞活化产生过度细胞外基质的sirna序列，所述sirna的rna序列如下所示的序列，或其任何位置进行化学修饰、替换、缺失或添加得到的有相同功能的序列。
9.5'-ccatgatcattaggactcttt-3’(seq id no:1)；
10.5'-agagtcctaatgatcatggtt-3’(seq id no:2)；
11.所述3’端末端两个t为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
12.进一步地，所述的sirna分子,在上述的rna单链中，至少一条链经过如下1)-13)所示的任意化学修饰后互补而成的sirna分子；
13.1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；
14.2)核糖或脱氧核糖的2
’‑
甲氧基修饰；
15.3)核糖或脱氧核糖的2
’‑
氟修饰；
16.4)锁核酸修饰；
17.5)开环核酸修饰；
18.6)吲哚修饰；
19.7)碱基的5－甲基胞嘧啶修饰；
20.8)碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰；
21.9)单链5’末端胆固醇修饰；
22.10)单链3’末端半乳糖修饰；
23.11)单链5’末端多肽修饰；
24.12)单链5’末端磷酸化修饰；
25.13)单链5’末端荧光标记修饰。
26.本发明第二个目的是提供一种能产生所述的sirna分子的dna分子。
27.本发明第三个目的是提供所述的抑制ccr4基因表达的sirna分子在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。
28.本发明中所述的“肺纤维化”为本领域常规的肺纤维化。所述肺纤维化较佳地是指以特发性肺纤维化病理改变为特征的，由各种不同因素所导致的肺纤维化。其中所述的肺纤维化较佳地是指人或动物的肺纤维化，所述肺纤维化的症状更佳地包括：由肺纤维化引起的肺部炎症、由肺纤维化引起的肺功能退化。所述的肺纤维化的病因较佳地为：由肺损伤引起的肺纤维化、由于粉尘引起的肺纤维化或者由于药物引起的肺纤维化，其中所述的药物较佳地为博莱霉素。
29.其中所述的肺纤维化较佳地是原发性(特异性)的肺纤维化，即原因不明的肺纤维化；或者是继发性的肺纤维化，即是继发于原先疾病的肺纤维化，所述肺纤维化更佳地是肺纤维化中的肺功能退化，肺部炎症和肺损伤。所述的肺纤维化的疾病较佳地包括慢性阻塞性肺病(copd)、特发性肺纤维化或间质性肺炎。
30.本发明所述“治疗”是指减轻肺纤维化的程度，或者治愈肺纤维化使之正常化，或者减缓肺纤维化的进程。
31.所述的治疗肺纤维化的药物较佳地为一种药物组合物，所述药物组合物的剂型没有特别限制，为本领域常规剂型。所述药物组合物的剂型较佳地是固体、半固体或液体。所述药物组合物的剂型也可以是水溶液、非水溶液或混悬液。该药物组合物的剂型更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂。所述药物组合物的给药途径为本领域常规的给药途径，所述给药途径较佳地为注射给药或口服给药。其中所述注射给药的方式较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径。
32.本发明第四个目的是提供一种治疗肺纤维化的药物，所述的药物含有所述的抑制ccr4基因表达的sirna，或者还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
33.在治疗肺纤维化时，本发明所述的药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。
34.进一步的，所述肺纤维化包括原发性肺纤维化或继发性肺纤维化。
35.进一步的，所述肺纤维化为药物性肺纤维化。
36.进一步的，所述药物性肺纤维化为博来霉素引起的药物性肺纤维化。
37.进一步的，所述产品通过治疗肺部炎症、肺功能退化或肺损伤进行肺纤维化的治疗。
38.本发明的第五个目的是提供所述的sirna在制备靶向降低ccr4表达，抑制ccl17作用，减少成纤维细胞活化产生过多细胞外基质任一种制剂中的应用。
39.本发明有益技术效果：本发明提供了可特异性抑制ccr4表达的sirna，该sirna能够靶向降低ccr4表达，抑制ccl17作用，减少成纤维细胞活化产生过多细胞外基质，从而应用于抗肺纤维化的药物的制备中。利用上述sirna所制备的药物在治疗肺纤维化疾病中，具有疗效显著，毒副作用小，使用安全的优点。
附图说明
40.图1为实施例5中马松染色的病理图片；
41.图2为实施例5中使用chemidoxtm xrs+和image labtm软件(bio-rad,hercules,california,usa)和化学发光检测试剂(tanon)对条带进行可视化的结果。
具体实施方式
42.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
44.本发明所用试剂和原料均市售可得。
45.实施例中所述的pbs，指浓度为0.1m，ph值为7.2的磷酸盐缓冲液。
46.实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为15-30℃。
47.实验结果用均值
±
标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p《0.05认为有显著性差异，p《0.01认为有极其显著性差异。
48.实施例1制备肺纤维化动物模型
49.1.1主要试剂及实验动物
50.实验所用博莱霉素购自日本化药，批号x81040。
51.实验中所使用的化合物若无特别说明，均购买自sigma公司。
52.实验所用的spf级c57bl/6小鼠(雄性，6-8周龄，16-18g)，购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
53.1.2肺纤维化动物模型的制备
54.雄性c57bl/6(周龄6-8周)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，气管
内注射博莱霉素(1u/kg)，共给药6次，每次时间间隔为14天。
55.具体方案为：将小鼠麻醉后俯卧位固定，用冷光灯源照射小鼠颈部位置，右手执镊将小鼠舌头往外牵引，左手执镊尽可能的将口腔打开，直至暴露声门，然后在导丝的介导下将20g套管针插入小鼠气管，之后使用微量进样针向气管内注入约50μl博莱霉素，迅速地旋转并直立5分钟，以便使博莱霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约60℃左右的手术操作台进行。假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水。
56.实施例2用实时荧光定量pcr方法筛选抑制ccr4表达最佳的sirna
57.具体步骤如下：
58.1.将人成纤维细胞铺于六孔板；
59.2.细胞贴壁后，使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)瞬时转染100pmolccr4-sirna及ccr4-sirna-2,同时转染sinc作为对照。ccr4-sirna序列如下：
60.5'-ccatgatcattaggactcttt-3’；见seq id no.1所示；
61.5'-agagtcctaatgatcatggtt-3’；见seq id no.2所示；
62.ccr4-sirna-2序列如下：
63.5'-gcaagatcgtttcatggattt-3’；见seq id no.3所示；
64.5'-atccatgaaacgatcttgctt-3’；见seq id no.4所示；
65.上述四条序列3’端末端两个t为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
66.3.转染48h后，收取细胞，提取rna。采用rna快速提取试剂盒(上海奕杉生物)步骤如下
67.(1)吸干培养基，用1ml的pbs洗一次。
68.(2)加入500μl的lysis buffer，用力吹吸10次，转移至ep管中，vortex10秒钟以充分裂解细胞。
69.(3)向裂解的细胞中加入等体积的无水乙醇充分混匀，然后将液体加入试剂盒中的结合柱中。
70.(4)4000
×
g离心一分钟，弃掉液体。
71.(5)使用600μl的wash buffer，12000
×
g离心一分钟，弃掉液体。
72.4.然后将提取的rna反转录成为cdna，采用快速逆转录试剂盒(上海奕杉生物)步骤如下：
73.(1)取100ng-2μg总rna，加入2μldna酶，加水至16μl，用移液枪轻柔的吹打5-10次混匀。
74.(2)室温反应5分钟，至于冰上待用。
75.(3)然后在上述体系中加入4μl的5
×
rt mix。
76.(4)用移液枪吹打10次，充分混匀。
77.(5)42℃反应15分钟。稀释5-10倍作为模板进行qpcr。
78.qpcr引物：
79.gapdh
80.forward:5'-gtctcctctgacttcaacagcg-3'；见seq id no.5所示；
81.reverse:5'-accaccctgttgctgtagccaa-3；见seq id no.6所示；
82.ccr4
83.forward:5'-ctctggctttgttcactgctgc-3'；见seq id no.7所示；
84.reverse:5'-agcccagtattggcagagaca-3；见seq id no.8所示。
85.设计人gapdh和ccr4的qpcr引物，以逆转录得到的cdna作为模板进行qpcr。qpcr采用体系是：kapa酶10μl，引物200nm，模板50ng，水8μl。
86.结果显示：sirna能显著下调成纤维细胞中ccr4的表达。结果见表1。
87.表1ccr4-sirna处理过的成纤维细胞的ccr4 mrna水平
88.分组ccr4表达量p值a：sinc组1.23
±
0.08 b:ccr4-sirna组0.12
±
0.04《0.001(a vs.b)c:ccr4-sirna-2组0.86
±
0.02＞0.05(b vs.c)
89.实施例3用实时荧光定量pcr方法检测sirna抑制成纤维细胞的活化
90.具体步骤如下：
91.1.将人成纤维细胞铺于六孔板；
92.2.细胞贴壁后，使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)瞬时转染100pmol ccr4-sirna，同时转染sinc作为对照。
93.3.48小时后，分别使用pbs或重组人ccl17(50ng/ml)刺激3小时后收取细胞，提取rna。采用rna快速提取试剂盒(上海奕杉生物)步骤如下
94.(1)吸干培养基，用1ml的pbs洗一次。
95.(2)加入500μl的lysis buffer，用力吹吸10次，转移至ep管中，vortex10秒钟以充分裂解细胞。
96.(3)向裂解的细胞中加入等体积的无水乙醇充分混匀，然后将液体加入试剂盒中的结合柱中。
97.(4)4000
×
g离心一分钟，弃掉液体。
98.(5)使用600μl的wash buffer，12000
×
g离心一分钟，弃掉液体。
99.4.然后将提取的rna反转录成为cdna，采用快速逆转录试剂盒(上海奕杉生物)步骤如下：
100.(1)取100ng-2μg总rna，加入2μldna酶，加水至16μl，用移液枪轻柔的吹打5-10次混匀。
101.(2)室温反应5分钟，至于冰上待用。
102.(3)然后在上述体系中加入4μl的5
×
rt mix。
103.(4)用移液枪吹打10次，充分混匀。
104.(5)42℃反应15分钟。稀释5-10倍作为模板进行qpcr。
105.qpcr引物：
106.gapdh
107.forward:5'-gtctcctctgacttcaacagcg-3'；
108.reverse:5'-accaccctgttgctgtagccaa-3
109.acta2：
110.forward:5'-ctatgcctctggacgcaact-3'；见seq id no.9所示；
111.reverse:5'-cagatccagacgcatgatggca-3。见seq id no.10所示；
112.设计人gapdh和acta2的qpcr引物，以逆转录得到的cdna作为模板进行qpcr。qpcr采用体系是：kapa酶10μl，引物200nm，模板50ng，水8μl。
113.结果显示：使用ccr4-sirna敲低ccr4，能抑制ccl17诱导的成纤维细胞活化，降低acta2的表达。结果见表2。
114.表2ccr4-sirna处理过的成纤维细胞的acta2 mrna水平
115.分组acta2表达量p值a：pbs组0.90
±
0.07 b:ccl17+sinc组1.10
±
0.06《0.05(a vs.b)c:ccl17+ccr4-sirna组0.16
±
0.08《0.001(b vs.c)
116.实施例4用transwell方法检测sirna抑制成纤维细胞的迁移
117.1.将人成纤维细胞铺于六孔板；细胞贴壁后，使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)瞬时转染100pmol ccr4-sirna,同时转染sinc作为对照。
118.2.transwell迁移实验采用transwell室，过滤膜孔径为8μm(corning)。下表面预涂10μg/ml纤维连接蛋白的小室插入24孔培养板。将上述处理过的人成纤维细胞48h后注入上室，每孔1
×
104细胞，同时分别于下室培养基(mem培养基+0.4％fbs)中加入pbs或ccl17(50ng/ml)作为刺激因子。
119.2.12h后，用棉签去除滤网上方的非迁移细胞。用4％多聚甲醛固定后，用结晶紫染色液染色，在光学显微镜下4个随机视野计数。
120.结果显示：使用ccr4-sirna敲低ccr4，能抑制ccl17对成纤维细胞的促迁移作用。结果见表3
121.表3ccr4-sirna处理过的成纤维细胞的迁移数量
122.分组迁移细胞数量p值a：pbs组35.25
±
1.73 b:ccl17+sinc组78.5
±
3.24《0.001(a vs.b)c:ccl17+ccr4-sirna组41.75
±
2.217《0.001(b vs.c)
123.实施例5利用肺纤维化动物模型验证sirna的抗肺纤维化作用
124.5.1将实施例1制备的动物模型在造模10天后分组给药，分组和给药情况如表4所示：
125.表4肺纤维化动物模型在造模后的分组给药情况
[0126][0127]
5.2马松染色病理影像学分析
[0128]
马松染色是胶原纤维染色经典而权威的方法，染色后的肌纤维呈红色，而胶原纤维呈蓝色，主要区别肌纤维和胶原纤维。
[0129]
取动物右侧下叶肺组织，4％多聚甲醛固定后石蜡包埋。在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片，马松染色观察纤维化状况。应用高清晰素彩色病理图文分析系统spot advanced 3.0获得高清晰的马松特殊染色的病理图片(100倍),结果见图1。结果显示，博来霉素给药后小鼠肺组织中的蓝色胶原纤维面积显著增加，而给予ccr4-sirna治疗后，小鼠肺组织中的蓝色胶原纤维面积显著减少。
[0130]
5.3肺纤维化小鼠羟脯氨酸含量测定
[0131]
羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此通过羟脯氨酸检测胶原蛋白的含量。检测动物左肺全叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。具体方法如下：取实施例1制备所得模型动物的左侧全部肺叶，记录湿重，生理盐水超声匀浆制备成10％的组织匀浆，取约150μl的匀浆上清液，加500μl碱水解液，涡旋混匀后，120度0.1kpa条件下碱水解法处理40min(方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书，略有改动)，调ph值后定容，活性炭处理后取上清。按照说明书(氯胺t法)进行羟脯氨酸测定。结果见表5，从表5可见，ccr4-sirna治疗后可以显著降低纤维化小鼠肺部羟脯氨酸的含量，说明纤维化病理得以改善。
[0132]
表5ccr4-sirna降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量
[0133][0134]
5.4western blot检测肺纤维化小鼠的α-sma蛋白
[0135]
1.用含有蛋白酶抑制剂(mce,hy-k0010)的ripa缓冲液(beyotime,p0013c)加研磨珠于组织研磨仪裂解，收获组织总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至相同浓度。按比例加入5
×
sds凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性10min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0136]
2.蛋白经sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到pvdf膜上。用脱脂牛奶封闭后，pvdf膜与抗gapdh和α-sma的抗体在4℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。使用chemidoxtm xrs+和image labtm软件(bio-rad,hercules,california,usa)和化学发光检测试剂(tanon)对条带进行可视化。结果见图2。经western-blot分析软件(gelpro32)测出各条带的光密度值分析，结果见表6。表6结果表明，ccr4-sirna治疗后可以显著降低纤维化小鼠肺组织α-sma表达量，说明纤维化病理得以改善。
[0137]
表6ccr4-sirna降低肺纤维化小鼠肺组织α-sma表达
[0138]
蛋白名称模型组ccr4-sirna给药组p值肺纤维化组织α-sma表达34819.34
±
15.7312929.14
±
5.32《0.001
[0139]
本实验中，通过病理学检查、病理影像学以及其他手段分析结果发现，ccr4-sirna能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化；显著降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、胶原含量。上述实验结果证明，ccr4-sirna在肺纤维化方面具有极好的治疗前景。
[0140]
上述实施例结果表明，本发明的sirna具有显著的抗肺脏纤维化疾病的作用，可作为活性成份用于制备抗肺纤维化的药物。
[0141]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。