一种重组酪氨酸酶突变体及其应用

1.本发明涉及一种重组酪氨酸酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.茶黄素(theaflavins，tfs)最早是在1957年由roberts e.a.h从红茶中分离发现，是一类由多酚类物质氧化缩合而成的、能溶于乙酸乙酯呈橙黄色、并具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称。目前已发现并进行结构鉴定的tfs有近30种，其中的主要成分有:茶黄素(theaflavin,tf)、茶黄素-3-单没食子酸酯(theaflavin-3-gallate,tf-3-g)、茶黄素-3'-单没食子酸酯(theaflavin-3'-gallate,tf-3'-g)和茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯(theaflavin-3,3'-gallate,tf-3,3'-g)等。红茶中的茶黄素含量一般为0.3％～1.5％,它们是红茶中的主要成分，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用，能让红茶汤色“亮”，具有较强的滋味和鲜爽度，被誉为茶叶中的“软黄金”，且安全性高。茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，还具有多种对人体健康有益的生理活性，如抗氧化、防癌抗癌、降血脂、预防心血管疾病、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等，此外，茶黄素还是化妆品、食品的天然着色剂。因而受到国内外广泛关注，并成为研究热点。
3.目前，制备茶黄素的方法大致有三种:萃取法、化学氧化法﹑酶促氧化法。萃取法：由于茶黄素在红茶中含量低微，因而从红茶中直接提取、纯化茶黄素的难度大，且得率低；化学氧化法：需要使用大量的铁氰化钾、三氧化铁、氧化镁以及酸碱等化学试剂，环境污染严重，需要投入更多的污水处理费用，并且由于化学法缺乏底物专一性，副产品复杂，产品纯度、安全性受到限制；酶促氧化法反应条件温和、可控性强，能避免上述两种方法的弊端，体外酶促氧化是一种比较合适的方法。然而，在茶发酵过程中生成tfs，是通过细胞的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo)将儿茶素(catechin)酶促氧化缩合而成。但自然生成酶量极低且受季节变化影响较大，因而直接从植物中规模化获取多酚氧化酶较困难。大量研究表明，通过蛋白质工程获取外源酶来工业化生产tfs，不但可以提高tfs的产量，而且能解决季节性限制的问题。
4.但是，在多酚氧化酶(漆酶、儿茶酚氧化酶和酪氨酸酶)中，酪氨酸酶(ec 1.14.18.1)由于具有广泛的底物选择性而特别重要。酪氨酸酶可以广泛催化多酚类、氨基酚类、甲氧基酚类、芳香胺类、无机或有机金属化合物等的氧化。它们在结合分子氧时被激活，可以催化单酚酶反应周期或二酚酶反应周期。酶与外部的二酚分子(如l-dopa)结合，并将其氧化为与水分子一起释放的邻醌，使酶处于中间过渡状态。然后酶结合第二个二酚分子，重复这个过程，最后以脱氧状态结束。通过酪氨酸酶体外酶促氧化制备茶黄素，对选中的母本酪氨酸酶进行蛋白质工程改造，提高区域选择性，优化转化条件，拟解决多酚氧化酶的来源和成本问题，提高茶黄素产量。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种重组酪氨酸酶bm tyr突变体，所述重组酪氨酸酶bm tyr突变体
的亲本酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
6.所述重组酪氨酸酶bm tyr突变体的亲本酶是来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megatherium)的酪氨酸酶bm tyr。
7.本发明还提供了一种酪氨酸酶bm tyr变体，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr亲本酶的第218位、第215位、第209位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到。
8.本发明所述的上述第218位、第215位、第209位的突变位点的编号，是按照重组酪氨酸酶bm tyr的原始来源序列(氨基酸序列如seq id no.1)进行编号的。
9.在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(f)任一：
10.(a)所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺得到的，突变体命名为v218n；
11.(b)所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr的第215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸得到的，突变体命名为m215e；
12.(c)所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr的第209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为r209s；
13.(d)所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，同时将215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸得到的，突变体命名为v218n/m215e；
14.(e)所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，同时将209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为v218n/r209s；
15.(f)所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的酪氨酸酶bm tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，第215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸，同时将209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为v218n/m215e/r209s。
16.在本发明的一种实施方式中，所述重组酪氨酸酶bm tyr的核苷酸序列如seq id no.2所示。
17.本发明还提供了一种编码上述酪氨酸酶bm tyr突变体的基因。
18.本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
19.在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pet-28a为表达载体。
20.本发明还提供了表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
21.在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
22.在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以escherichia coli bl21(de3)为表达宿主。
23.本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述重组酪氨酸酶bm tyr突变体。
24.在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以escherichia coli bl21(de3)为表达宿主，以pet28a为表达载体。
25.本发明还提供了一种获得上述酪氨酸酶bm tyr突变体的方法，所述方法包括以下
步骤：
26.(1)在重组酪氨酸酶bm tyr氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带重组酪氨酸酶bm tyr基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；
27.(2)将含突变体的质粒载体转化进宿主细胞；
28.(3)挑选阳性克隆，将得到的重组细胞进行发酵培养，制备得到酪氨酸酶bm tyr突变体，并纯化酪氨酸酶bm tyr突变体。
29.在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
30.本发明还提供了一种茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的制备方法，所述方法为，
31.将上述重组酪氨酸酶bm tyr突变体，或将上述重组细胞进行破碎离心后收集上清液，或上述重组大肠杆菌进行破碎离心后收集上清液，添加至含有表没食子儿茶素3-没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的反应体系中，进行反应制备得到。
32.在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞，或上述重组大肠杆菌破碎离心后收集的上清液，即：所述的重组酪氨酸酶bm tyr突变体酶液，在反应体系中添加的终浓度为4～10μg/ml。
33.在本发明的一种实施方式中，所述重组酪氨酸酶bm tyr突变体酶液在反应体系中添加的终浓度为5μg/ml。
34.在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌上清液中添加的cu
2+
终浓度0.1mm。
35.在本发明的一种实施方式中，所述表没食子儿茶素3-没食子酸酯在反应体系中的终浓度为：3g/l。
36.在本发明的一种实施方式中，所述表儿茶素没食子酸酯在反应体系中的终浓度为：2g/l。
37.在本发明的一种实施方式中，反应条件为：在ph 5.5～8.0、30～50℃、条件下反应10～60min。
38.本发明还提供了上述重组酪氨酸酶bm tyr突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸，或含有茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的产品中的应用。
39.在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
40.有益效果
41.(1)本发明提供了一种重组酪氨酸酶bm tyr及其突变体，用于催化生产茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸。本发明重组酪氨酸酶bm tyr实现了在escherichia coli bl21(de3)可溶性表达，且表儿茶素没食子酸酯活性较对照组提高了5.02倍。
42.(2)本发明重组酪氨酸酶bm tyr突变体氧化表儿茶素没食子酸酯活性，相对于重组酪氨酸酶bm tyr提高了1.14～6.26倍，且重组酪氨酸酶bm tyr突变体表现出较高的表儿茶素没食子酸酯活性，在30℃、ph 5.0的条件下反应0.5h，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸时空产量达到36.01g/l/d，转化率为47.8％。采用本发明的方法，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，降低了反应的成本，加快了酶转化法生产茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的工业化进程。
附图说明
43.图1：来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megatherium)的酪氨酸酶bm tyr诱导表达的sds-page图；泳道m是指低分子量蛋白marker；泳道1～3分别是25℃下0.2mm iptg浓度诱导表达后全细胞、沉淀和上清液中目的蛋白条带大小。
44.图2：各突变体转化生成茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的转化率。
45.图3a：表没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯标准品的色谱图。
46.图3b：茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸标准品的色谱图。
47.图3c：酪氨酸酶bm tyr转化生成茶黄素-3,3'-双没食子酸的色谱图。
具体实施方式
48.下述实施例中所涉及的pet-28a(+)质量购自novagen(madison,wi,u.s.a.)，限制性内切酶、t4 dna连接酶、primestar等购自takara(dalian,china)。标品表没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸购自美国sigma-aldrich及aladdin公司，其余试剂均为市场购买所得。
49.下述实施例中所涉及的培养基如下：
50.lb液体培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，在121℃灭菌20min。
51.lb固体培养基：在lb液体培养基基础上，添加2％的琼脂。
52.tb液体培养基：kh2po
4 2.31g/l，k2hpo4·
3h2o 16.42g/l，酵母粉24g/l，蛋白胨12g/l，甘油4g/l。
53.配制ph 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：0.2mol/l的磷酸氢二钠和0.1mol/l的柠檬酸混合缓冲液，具体配方见《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，诸葛健主编)
54.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
55.酪氨酸酶bm tyr酶活的检测：
56.将表没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，配制成20g/l的溶液。在反应体系中，表没食子儿茶素3-没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的终浓度分别为3g/l、2g/l，混匀后加入20μl含有0.1mm cu
2+
的酶溶液。30℃，400rpm震荡反应5min,反应后加入50μl 2m三氯乙酸终止反应，于12000rpm条件下离心5～10min，过0.22μm有机膜，进行高相液相色谱法hplc分析。
57.酶活力定义为：以表没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯为反应底物，30℃条件下，每分钟生成1μmol茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，记为u
·
ml-1
。
58.表没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸含量的检测：
59.以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为反应介质对酪氨酸酶转化表没食子儿茶素3-没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯生成茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的影响。转化的底物表没食子儿茶素3-没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的终浓度分别为3g/l、2g/l，20μl含有0.1mm cu2+的酶溶液，于30℃，400rpm震荡反应5min,反应后加入50μl 2m三氯乙酸终止反应，于12000rpm条件下离心5～10min，过0.22μm有机膜，进行高相液相色谱法hplc分析。
60.上述具体的高效液相色谱法hplc分析方法为：
61.以100diol(5μm，250
×
4mm)作为色谱柱，以经过抽滤、超声脱气的2％乙酸-水(v/v)(a)和乙腈(b)为流动相，色谱柱温度，25℃；流速，1.0ml/min；注射体积，5μl；检测波长，278nm；梯度洗脱：0-5min，30％b；5-8min，30-34％ b；8
–
11min，34
–
38％ b；11
–
13min，38
–
30％ b；13-18min，30％b，样品处理时间为15min。在此检测条件下，表没食子儿茶素3-没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的保留时间分别为3.062min、3.561min、5.525min。
62.实施例1：bm tyr的表达与纯化
63.基因工程菌的构建及蛋白的表达：
64.以f1：ggtcgcggatccgaattcatgagtaacaagtat和r1：agcttgtcgacggagctcttatgagg aacg为引物，下划线分别是ecor i和sac i限制性酶切位点。
65.以ncbi中公开的巨大芽孢杆菌bacillus megatherium中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(seq id no.2所示)为模板，扩增条件为95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃1.5min)，72℃5min，获得tyr基因编码区cdna序列，获得tyr基因编码区cd na序列，pcr产物回收后与经同样双酶切的pet-28a(+)质粒载体通过同源重组连接，获得重组表达质粒pet-28a(+)-bm tyr，将重组质粒pet-28a(+)-bm tyr转化入e.coli bl21(de3)，经过pcr鉴定，获得阳性的工程菌命名为e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr。
66.将工程菌e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr接入lb液体培养基，在37℃条件下，培养12h后得到种子液，将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的tb液体培养基，在37℃条件下，培养2h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，25℃培养14h，诱导表达重组目的蛋白。取150ml诱导发酵液经6000r/min离心收集菌体，结果如图1所示。
67.结果显示，不论是全细胞还是上清液和沉淀中，目的蛋白都得到了表达，并且条带大小相同。
68.实施例2：制备茶黄素-3,3'-双没食子酸
69.(1)粗酶液的制备
70.将从甘油管中保存的菌株e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr涂布于lb固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的lb液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养12h后得到种子液，将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的tb液体培养基，在37℃条件下，培养2h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，于25℃下诱导培养14h，制备得到发酵液。
71.将发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10ml结合液a(20mm磷酸钠、0.5mm nacl、20mm咪唑、1％甘油，用hcl调ph至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min，得到破碎液。
72.将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，分别得到粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，加入0.1mm cu
2+
备用。
73.(2)茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的制备
74.以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为反应介质，采用酪氨酸酶转化表没食子儿茶素3-没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，生成茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸。
75.向含有磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的反应体系中，添加终浓度为3g/l的底物表没食子儿茶素3-没食子酸酯和终浓度为2g/l的底物表儿茶素没食子酸酯并加入20μl含有0.1mm cu
2+
的酶溶液，于30℃，400rpm震荡反应5min，反应后加入50μl 2m三氯乙酸终止反应，于12000rpm条件下离心5～10min，过0.22μm有机膜，进行高相液相色谱法hplc分析(图3a～c)。
76.结果显示：茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的时空产量为：5.8g/l/d，转化率为：7.7％。
77.实施例3：酶的表达纯化及酶活性验证
78.具体步骤如下：
79.(1)粗酶液的制备
80.将从甘油管中保存的菌株e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr涂布于lb固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的lb液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养12h后得到种子液，将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的tb液体培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，于25℃下诱导培养14h，结束后收集发酵液。
81.将发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10ml结合液a(20mm磷酸钠、0.5mm nacl、20mm咪唑、1％甘油，用hcl调ph至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得到粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，加入0.1mm cu
2+
备用。
82.(2)酪氨酸酶bm tyr的纯化
83.准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入超纯水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10ml结合液a平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液ph值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液a冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液b(20mm磷酸钠、0.5mm nacl、500mm咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。
84.对纯化后的bm tyr的纯酶液进行酶活的检测，bm tyr酶活13.37u
·
ml-1
。
85.实施例4：单突突变体的构建和筛选
86.具体步骤如下：
87.以实施例2构建得到的pet-28a(+)-bm tyr为模板，设计bm tyr
v218n
、bm tyr
m215e
、bm tyr
r209s
、bm tyr
r191e
突变位点的引物，如表1所示，通过全质粒pcr进行突变体构建。
88.表1：单突变体突变引物序列
[0089][0090]
构建反应pcr扩增体系：primstar酶0.5μl、5
×
primestar buffer 10μl、dntp 4μl每个突变位点的两条引物各1μl，模板(sr
mbp
pld
wt
)4μl、水32.5μl；
[0091]
反应条件为：
①
94℃3min；
②
98℃10s；
③
55℃30s；
④
72℃3min；
⑤
将
②
～
④
三个步骤循环29次；
⑥
72℃5min；
⑦
12℃保温。
[0092]
将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：dpni 0.5μl、上述反应pcr产物45μl、10
×
t buffer 5μl)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌bl21感受态细胞。
[0093]
化学转化法具体步骤：(1)将10μl同源重组产物导入100μl e.coli bl21(de3)感受态细胞；(2)冰浴15-30min；(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；(4)加入800μl无抗性lb培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；(5)5000rpm离心2min收菌；(6)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/ml卡那霉素lb抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。(7)挑取单克隆于含0.05mg/ml卡那霉素抗性lb中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。
[0094]
分别制备得到基因工程菌e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
m215e
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
r209s
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
r191e
。
[0095]
随后将得到的上述基因工程菌按照实施例2的方法，进行转化制备茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸，筛选出较好的突变体，结果如表2及图2所示
[0096]
表2：单突变体茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的转化率
[0097][0098]
结果显示，工程菌e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
m215e
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
r209s
生成茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的效果比较好，是野生型e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr的1.14-1.30倍。
[0099]
实施例5:双突变体、三突变体的构建和筛选
[0100]
(1)双突变体构建：
[0101]
本实施例的双突变体是在相应的单突变体的基础上，按照表3中的引物，通过全质粒pcr进行双突突变体构建，例如，在突变体bm tyr
v218n
的基础上，利用突变引物利用突变引物r209s-f和r209s-r(表3)，通过全质粒pcr进行双突突变体e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n/209s
构建。
[0102]
表3双突变体突变引物序列
[0103][0104]
基因工程菌的制备方法参见实施例2中步骤(1)，所用引物如表3所示，按照实施例4的方法，制备得到含有双突变体基因工程菌：e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n/209s
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n/m215e
、e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n/r191e
。
[0105]
(2)双突变体的筛选：
[0106]
将测序正确的的突变体菌株接种至lb种子培养基，200rpm、37℃培养培养10h，分别将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的tb液体培养基，在200rpm、37℃培养至od
600
＝0.8左右，加入终浓度为0.2mm iptg诱导，诱导条件为200rpm、25℃诱导14h。
[0107]
随后将得到的上述基因工程菌按照实施例2的方法，进行转化制备茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸。
[0108]
反应结束后，用hplc方法进行测定茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的产量，结果如表4所
示。
[0109]
表4：双突变体茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的转化率
[0110][0111]
结果显示：含有突变体bm tyr
v218n/m215e
基因工程菌和突变体bm tyr
v218n/m215e
基因工程菌的效果最好，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的转化率分别可以达到29.9％和36.7％。
[0112]
(3)三突突变体的构建：
[0113]
在突变体bm tyr
v218n/m215e
的基础上，利用突变引物r209s-f和r209s-r(表3)，通过全质粒pcr进行三突突变体构建，具体实施方式参见实施例2中步骤(1)，所用引物如表3所示，按照实施例4的方法，制备得到含有三突变体bm tyr
v218n/m215e/r209s
基因工程菌：e.coli bl21/pet-28a(+)-bm tyr
v218n/m215e/r209s
。
[0114]
按照实施例2的方法，进行转化制备茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸；反应结束后，用hplc方法进行测定茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的产量，含有三突变体bm tyr
v218n/m215e/r209s
基因工程菌制备得到的茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸的时空产量达到36.01g/l/d，转化率为47.8％。
[0115]
(4)突变体酶活的检测
[0116]
对实施例4和5中得到的有益突变体进行了酶活验证，具体实施方式参见实施例3。分别对纯化后的各个突变体的纯酶液进行了酶活的检测，结果如表5所示。
[0117]
表5：有益突变体的酶活数据
[0118][0119][0120]
结果显示，最佳的三突变体bm tyr
v218n/m215e/r209s
酶活为83.06u
·
ml-1
，相对于野生型b m tyr(13.37u
·
ml-1
)提高了6.26倍。
[0121]
实施例6：亲本酶和突变体的性能测定
[0122]
(1)动力学参数的测定
[0123]
为了对有益突变体进行评价，本发明测定了突变亲本q0及突变体q1至q6(具体含
义如表7所示)在30℃下的动力学参数。k
cat
/km通过30℃条件下测定不同浓度的氧化表儿茶素没食子酸酯所产生的醌类物质的初始利率计算。具体实施步骤参见文献comparison of spectrophotometric assaymethods for theaflavins and thearubigins in black tea，[j].journal of tea,1995,16(1):41～47.和《生物化学》(高等教育出版社，王镜岩主编)。结果如表7所示。
[0124]
(2)比酶活的检测
[0125]
按照比酶活的检测方法(酶活检测除以酶质量)，分别检测bm tyr亲本酶及其突变体的比酶活数据。结果如表6所示。
[0126]
表6：bm tyr亲本酶及其突变体的动力学参数
[0127][0128]
结果显示，突变体的km值较wt均有降低，其中三突变体的km最低，说明三突变体对底物的亲和力有所增加。三突变体bm tyr
v218n/m215e/r209s
的催化效率v
max
/km(18.65mm-1
·
s-1
)比wt(3.29mm-1
·
s-1
)提高4.67倍。
[0129]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。