用于检测蜜源植物的组合物、试剂盒、检测方法及应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于检测蜜源植物的组合物、试剂盒、检测方法及应用。


背景技术：

2.目前，蜂蜜，是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质。蜜源植物种类繁多，如油菜蜜、槐花蜜、荆条蜜、枣花蜜、龙眼蜜、荔枝蜜等等。不同蜜源蜂蜜价格相差较大，高端价位如龙眼蜜和荔枝蜜，低端价位如油菜蜜等。蜂蜜掺假中一种较为普遍的做法是将低价蜜源蜂蜜掺入高价蜜源蜂蜜。针对这类掺假，传统的检测方法，如感官法、物理性状、化学成分分析等，由于受到生产、加工、贮藏条件影响存在很多不确定性。分子生物学技术通过检测植物物种特异性基因片段来判断蜜源，具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
4.现有蜂蜜存在将低价蜜源蜂蜜掺入高价蜜源蜂蜜的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测蜜源植物的组合物、试剂盒、检测方法及应用。
6.本发明是这样实现的，一种用于检测蜜源植物的组合物、试剂盒、检测方法及应用，实时荧光pcr反应的反应体系总体积25μl，荧光pcr预混液2
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mix12.5μl，模板dna3μl，引物对(各10μmol/l)各1μl、探针(10μmol/l)0.5μl和ddh2o7μl。扩增程序为，95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火60s，共进行50个循环，每个循环结束后收集荧光信号，ct≤45为阳性。所述组合物包含以下(1)至(4)中的引物和探针序列：
7.(1)油菜特异性寡核苷酸引物对seq id no.1和seq id no.2以及探针seq id no.3序列；
8.(2)洋槐特异性寡核苷酸引物对seq id no.4和seq id no.5以及探针seq id no.6序列；
9.(3)荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对seq id no.7和seq id no.8以及探针seq id no.9序列；
10.(4)龙眼特异性寡核苷酸引物对seq id no.10和seq id no.11以及探针seq id no.12序列。
11.进一步，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团，5’端连接有荧光报告基团，所述荧光淬灭基团为tamra，所述荧光报告基团为fam。
12.进一步，蜜源植物为荔枝、龙眼、洋槐和油菜中的一种或多种。
13.进一步，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的组合物。
14.进一步，所述方法包括使用权利要求1-3中任一项所述的组合物或权利要求4所述
的试剂盒。
15.进一步，所述的实时荧光pcr检测方法，其为taqman荧光探针法。
16.进一步，所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在鉴别蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。
17.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
18.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
19.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
20.本发明的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测蜂蜜中的荔枝、龙眼、洋槐、油菜蜜源植物成分。通过本发明，不仅能检测蜂蜜中花粉沉淀中提取的dna，而且能检测蜂蜜上清中提取的dna，能有效防止蜂蜜中添加花粉或过滤花粉的造假方式。
21.本发明的发明人根据油菜的隐花色素2b基因，设计了能够特异性检测油菜成分的引物和探针；根据洋槐叶绿体pseudoacaciamaturasek基因，设计了特异性检测洋槐成分的引物和探针；根据荔枝成熟酶k基因，设计了能同时特异性检测荔枝和龙眼成分的引物和探针。根据龙眼叶绿体铁超氧化物歧化酶(fsd1b)基因，设计了特异性检测龙眼成分的引物和探针。这些基因靶序列小于100bp，保证能从蜂蜜沉淀及上清中检测目标植物成分。
22.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
23.本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明能检测蜂蜜中花粉沉淀中提取的dna，而且能检测蜂蜜上清中提取的dna，能有效防止蜂蜜中添加花粉或过滤花粉的造假方式。
附图说明
24.图1是本发明实施例提供的利用实时荧光pcr特异性检测油菜dna(cryptochrome2b)区序列时，油菜样品出现典型的扩增曲线。其中使用油菜特异性寡核苷酸引物对seq id no.1和seq id no.2和探针seq id no.3检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.油菜；2.荔枝；3.洋槐；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.桂圆；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图1中的横坐标为pcr循环数，纵坐标为pcr相对荧光单位值。
25.图2是本发明实施例提供的利用实时荧光pcr特异性检测洋槐dna(pseudoacaciamaturasek)序列时，洋槐样品出现典型的扩增曲线。其中使用洋槐特异性寡核苷酸引物对seq id no.4和seq id no.5和探针seq id no.6检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.洋槐；2.荔枝；3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.桂圆；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图2中的横坐标为pcr循环数，纵坐标为pcr相对荧光单位值。
26.图3是本发明实施例提供的利用实时荧光pcr特异性检测荔枝dna(成熟酶k)序列时，荔枝和龙眼样品出现典型的扩增曲线。其中使用荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对seq id no.7和seq id no.8和探针seq id no.9检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.荔枝；2.龙眼；3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.洋槐；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图3中的横坐标为pcr循环数，纵坐标为pcr相对荧光单位值。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
29.检测主要试剂：
30.氯仿、异丙醇分别产于北京六合通公司；ctab裂解液(20g/lctab，1.4mol/lnacl，0.1mol/ltris、0.02mol/lna
2-edta)、ctab沉淀液(5g/lctab，0.04mol/lnacl)、1.2mol/lnacl均为本实验自行配制；faststartuniversalprobe mastermix(rox)产于罗氏公司；引物及探针由上海奥科生物科技有限公司合成等。
31.二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
32.选取油菜蜜、荔枝蜜、洋槐蜜、龙眼蜜及其混合物进行实时荧光pcr反应，以确定所建立的实时荧光pcr方法的可行性、特异性、实际灵敏度等。
33.常规地，扩增待测样品时，重复3次出现1次以上阳性信号即代表检测结果为阳性。
34.以荔枝蜜和油菜蜜的混合物为例，用荔枝蜜和油菜蜜按不同比例混合。荔枝蜜和油菜蜜的比例分别为100％、99.9％、90％、50％、10％、5％、1％和0.1％。利用nucleospin试剂盒从混合物的沉淀物中提取dna后使用荔枝特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到0.1％的荔枝蜜。利用nucleospin试剂盒从上述蜂蜜混合物上清中提取dna，使用荔枝特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到0.1％的荔枝蜜。
35.以荔枝蜜和油菜蜜的混合物为例，用荔枝蜜和油菜蜜按不同比例混合。油菜蜜和荔枝蜜的比例分别为100％、99.9％、90％、50％、10％、5％、1％和0.1％。利用nucleospin试剂盒从混合物的沉淀物中提取dna后使用油菜特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到0.1％的油菜蜜。从上述蜂蜜混合物上清中提取dna，使用油菜特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到5％的油菜蜜。
36.以龙眼蜜和洋槐蜜的混合物为例，用龙眼蜜和洋槐蜜按不同比例混合。龙眼蜜和洋槐蜜的比例分别为100％、99.9％、90％、50％、10％、5％、1％、0.1％。分别从混合物的沉淀物中提取dna后使用龙眼特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到1％的龙眼蜜。从上述蜂蜜混合物上清中提取dna，使用龙眼特异性引物和探针组合进行实
时荧光pcr，结果说明可以检测到1％的龙眼蜜。
37.以龙眼蜜和洋槐蜜的混合物为例，用龙眼蜜和洋槐蜜按不同比例混合。洋槐蜜和龙眼蜜的比例分别为100％、99.9％、90％、50％、10％、5％、1％、0.1％。分别从混合物的沉淀物中提取dna后使用洋槐特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到0.1％的洋槐蜜。从上述蜂蜜混合物上清中提取dna，使用洋槐特异性引物和探针组合进行实时荧光pcr，结果说明可以检测到0.1％的洋槐蜜。
38.三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
39.实时荧光pcr反应体系：
40.taqmanuniversalpcrmastermix12.5μl
41.探针(10μm)2μl
42.上游引物(10μm)1μl
43.下游引物(10μm)1μl
44.模板dna5μl
45.加ddh2o至总体积为25μl
46.注：每次pcr检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替dna模板，检测试剂是否受到污染)；
47.4)实时荧光pcr反应参数：
48.95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min，40个循环。
49.注：不同仪器应将pcr各试剂及反应参数做适当调整。
50.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。