2-（环己-2-烯-1-亚基）丙二腈衍生物及其合成方法和应用

本发明涉及去甲肾上腺素特异性荧光探针，具体属于一种2-(环己-2-烯-1-亚基)丙二腈衍生物及其合成方法和应用。

背景技术：

1、“兴奋、悲痛、暴力…”这些都受意识和行为支配。人的每一个意识和动作都源于神经元活动，神经元之间的信息传递依赖于神经递质的释放。由于长期缺乏高选择性、高灵敏和高时空分辨性能兼备的体内监测工具，神经递质被认为是大脑中的“暗物质”。造成中枢神经系统疾病病因和发病机制不详，病理分析手段脱离真实生物背景。现行研究手段、诊断方式对提高患者的治愈率存在局限。去甲肾上腺素是儿茶酚胺神经递质的一种，由蓝斑合成并广泛投射至整个大脑与脊髓。主要参与注意力、觉醒、学习、记忆、应激、心率、血压的高度调控。与阿尔兹海默病、帕金森、抑郁症和注意力缺陷等多种精神疾病和神经退行性疾病密切相关。要想参透以上疾病发病机制，对去甲肾上腺素监测的工具越来越提出更高的要求。小分子荧光探针在具有优异的生物兼容性，原位动态标记和高时空分辨成像等优点已被广泛用于生物样本实时原位荧光成像分析。这在疾病早期诊断、手术导航和肿瘤消融等方面展现出巨大应用潜力。

2、近年来，虽已开发了部分去甲肾上腺素特异性检测的小分子荧光探针，但受限于反应速率差，受干扰大，适用范围极其受限。这给开发快速、高选择性响应去甲肾上腺素新型分子荧光探针提出了更高的要求和挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种2-(环己-2-烯-1-亚基)丙二腈衍生物dcm-ne及其合成方法，以及dcm-ne对细胞受高浓度钾离子刺激时去甲肾上腺素释放与再摄取双向过程进行同步荧光监测的应用。

2、本发明提供的一种2-(环己-2-烯-1-亚基)丙二腈衍生物dcm-ne，中文名称为(e)-4-(2-(3-(二氰基甲基)-5，5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-2-甲酰基苯基-4-硝基苯甲酸酯，英文名称为(e)-4-(2-(3-(dicyanomethylene)-5,5-dimethylcyclohex-1-en-1-yl)vinyl)-2-formylphenyl4-nitrobenzoate。其结构式为：

3、

4、dcm-ne的合成方法，步骤为：

5、1)按摩尔比1:1.0～1.8将异佛尔酮、丙二腈和3～5滴哌啶溶解在适量无水乙醇中；接着将该混合物搅拌加热至回流并保持6～8小时，接着减压蒸发除去溶剂后用二氯甲烷和石油醚混合溶剂作为洗脱剂，经柱色谱纯化得到白色晶状固体化合物1；

6、2)按摩尔比1:1.0～1.6将化合物1、对羟基苯甲醛和3～5滴哌啶溶解在适量无水乙醇中，然后将该混合体系加热至回流6～10小时，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱剂进行柱色谱纯化得黄色固体粉末化合物2；

7、3)按摩尔比1:2.5～4.0将化合物2和乌洛托品溶解于适量三氟乙酸中，并在大约90℃加热8～12小时，待反应完成后，将反应体系倒入大量冰水中，充分沉淀后，用布氏漏斗过滤并用蒸馏水洗涤滤饼，然后用真空恒温干燥箱对收集的沉淀进行干燥；最后用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱剂进行柱色谱纯化，得橙红色固体粉末化合物3；

8、4)按摩尔比1:3.0～5.0将化合物3和三乙胺溶于二氯甲烷中，室温下搅拌3～5分钟；接着，向反应体系中加入2～4当量的对硝基苯甲酰氯，在室温下继续搅拌30～50分钟，使用tlc监测至反应完成；然后减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷和石油醚混合溶剂进行柱色谱纯化得黄色粉末产物即为dcm-ne。

9、上述合成的2-(环己-2-烯-1-亚基)丙二腈衍生物dcm-ne用于体外快速特异性定性与定量荧光检测去甲肾上腺素，以及该衍生物对细胞受高浓度钾离子刺激时伴随去甲肾上腺素释放与再摄取双向同步荧光监测，包括：

10、(1)、配置等体积二甲基亚砜和pb5.0(用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制ph＝5.0的磷酸缓冲液)混合缓冲溶液(简称测试体系)，配制100mmol/l的去甲肾上腺素水溶液(含50mmol/l硫代硫酸钠)、配制2mmol/ldcm-ne的二甲基亚砜溶液(简称探针母液)、配制100mmol/l五羟色胺水溶液、配制100mmol/l三磷酸腺苷水溶液、配制100mmol/l伽马氨基丁酸水溶液、配制100mmol/l谷氨酸水溶液、配制100mmol/l多巴胺水溶液(含50mmol/l硫代硫酸钠)、配制100mmol/l肾上腺素水溶液(含50mmol/l硫代硫酸钠)、配制40mmol/l谷胱甘肽水溶液、配制40mmol/l半胱氨酸水溶液、配制40mmol/l胱氨酸水溶液、配制40mmol/l甘氨酸水溶液、配制40mmol/l赖氨酸水溶液、配制40mmol/l酪氨酸水溶液和配制40mmol/l脯氨酸水溶液；

11、(2)、取10μl探针母液、2.0ml测试体系于比色皿中，添加100μl浓度为100mmol/l的去甲肾上腺素水溶液，在荧光分光光度计上以440nm紫外可见吸收作为激发光源监测635nm处荧光强度随时间的变化。随着时间的推移，荧光峰值由651nm向635nm蓝移且荧光强度逐渐增强。对635nm处荧光强度随时间变化进行分析，探针dcm-ne与去甲肾上腺素大约反应12分钟荧光强度趋于稳定；

12、(3)、将终浓度不同的去甲肾上腺素(0.1mmol/l,0.2mmol/l,0.3mmol/l,0.7mmol/l,1.0mmol/l,1.5mmol/l,2.0mmol/l)水溶液分别与终浓度为10μmol/l的dcm-ne在2.0ml测试液反应15分钟后记录635nm处荧光强度。绘制荧光强度与去甲肾上腺素浓度线性相关曲线。根据国际纯粹与应用化学联合会(简称iupac)计算检出限规则，计算可得探针dcm-ne对去甲肾上腺素检出限为64.3μmol/l；

13、(4)、将浓度为5.0mmol/l的五羟色胺、5.0mmol/l的三磷酸腺苷、5.0mmol/l的γ-氨基丁酸、5.0mmol/l的谷氨酸、5.0mmol/l的多巴胺、5.0mmol/l的肾上腺素、5.0mmol/l的去甲肾上腺素、2.0mmol/l的谷胱甘肽、0.2mmol/l的半胱氨酸、0.5mmol/l胱氨酸、0.5mmol/l的甘氨酸、0.5mmol/l赖氨酸、0.5mmol/l的酪氨酸和0.5mmol/l脯氨酸分别与10μmol/l探针dcm-ne在2.0ml测试体系中反应15分钟后，于荧光分光光度计上以440nm紫外可见吸收光为激发检测并记录635nm处荧光强度，结果显示去甲肾上腺素能引起明显的荧光增强，其他分析物无显著响应；

14、(5)将人卵巢透明细胞癌细胞es-2、人结肠癌细胞hct-116、宫颈癌细胞hela和嗜铬细胞瘤细胞pc12的培养基弃掉后分别与含10μl探针母液的2.0mlpbs共孵育20分钟，然后用pbs洗涤2次置于荧光共聚焦显微镜上。以488nm为激发光源监测各细胞在610～670nm波长范围红色通道荧光强度。图像显示仅pc12细胞具有显著荧光点亮，其他细胞无明显荧光增强；

15、(6)取10μl探针母液溶于2.0mlpbs(探针终浓度为10μmol/l)用于孵育pc12细胞20分钟后置于荧光共聚焦显微镜上，然后添加终浓度为1.5mmol/l的高浓度钾离子，以488nm为激发光源随时间监测610～670nm波长范围红色通道荧光强度变化。同样，以75μmol/l低浓度钾离子处理预孵育含10μmol/l探针的pbs，以488nm为激发随时间监测610～670nm波长范围红色通道荧光强度变化。对比显示高浓度钾离子处理的pc12细胞荧光强度随时间先降低再回升，低浓度钾离子处理的pc12细胞荧光强度稳定良好，呈缓慢降低趋势，无突变现象。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果：

17、1、本发明2-(环己-2-烯-1-亚基)丙二腈衍生物dcm-ne的合成便捷，操作方便；

18、2、利用探针dcm-ne中醛基与酯协同反应可实现对去甲肾上腺素快速、特异性检测，为设计新颖去甲肾上腺素分子荧光探针开辟了新途径；

19、3、检测手段简单，利用荧光光谱即可实现对去甲肾上腺素的体外定性与定量检测，使用共聚焦显微成像可实现对去甲肾上腺素在细胞水平特异性荧光标记和其释放与再摄取过程双向同步监测。光谱实验与细胞成像表明探针dcm-ne是检测去甲肾上腺素的良好传感器，这为神经性系统早期疾病的诊断提供新的工具。