一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用

一种高效异源同体表达mtsase和mthase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种高效异源同体表达mtsase和mthase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。


背景技术：

2.海藻糖(trehalose)是由两分子葡萄糖通过1,1-糖苷键连接而成的非还原性二糖。由于海藻糖具有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性和对生物大分子具有保护作用，其广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。
3.海藻糖生产主要途径包括磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法。其中双酶法是以麦芽糊精或淀粉糖化液为底物，麦芽糊精经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)催化生产麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖经过麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)催化生成海藻糖。双酶法具有生产成本低、转化率高、产物便于分离提取等特点，受到广泛关注。目前国内生产海藻糖内毒素含量较高，限制了海藻糖在食品和医药领域的应用。枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，不产生内毒素。但目前枯草芽孢杆菌对麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶异源的表达量比较低，限制了枯草芽孢杆菌在海藻糖生产中的应用。
4.为提高mtsase和mthase在枯草芽孢杆菌中的表达，本发明通过多位点整合的方式，提高基因拷贝数，进一步提高mtsase和mthase的表达；同时将mtsase和mthase在枯草芽孢杆菌中进行异源同体表达，降低mtsase和mthase的生产成本。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效异源同体表达mtsase和mthase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种高效异源同体表达mtsase和mthase重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：
8.步骤1、构建枯草芽孢杆菌amye位点整合质粒pdg-amye-p
43-mtsase-amye，包括如下步骤：
9.(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增组成型启动子p
43
基因片段；
10.(2)以嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)atcc 33909基因组为模板，pcr扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段；
11.(3)以pdg1730质粒为模板，反向pcr扩增获得pdgamye线性化载体基因片段；
12.(4)利用无缝克隆技术，分别将步骤(1)中的启动子p
43
基因片段、步骤(2)中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段、步骤(3)中的pdgamye线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌amye位点整合质粒pdg-amye-p
43-mtsase-amye。
13.步骤2、构建枯草芽孢杆菌laca位点整合质粒pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca，包括
如下步骤：
14.①
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增laca上游同源臂基因片段；
15.②
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增laca下游同源臂基因片段；
16.③
以pdg-amye-p
43-mtsase-amye质粒为模板，pcr扩增p
43-mtsase基因片段；
17.④
以pht01质粒为模板，pcr扩增获得氯霉素cm抗性基因片段；
18.⑤
以pdg1730质粒为模板，反向pcr扩增获得pdglaca线性化载体基因片段；
19.⑥
利用无缝克隆技术，分别将步骤
①
中的laca上游同源臂基因片段、步骤
③
中的p
43-mtsase基因片段、步骤
④
中的氯霉素cm抗性基因片段、步骤
②
中的laca下游同源臂基因片段、步骤
⑤
中的pdglaca线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌laca位点整合质粒pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca。
20.步骤3、构建枯草芽孢杆菌lipa位点整合质粒pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa，包括如下步骤：
21.[1]以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增lipa上游同源臂基因片段；
[0022]
[2]以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增lipa下游同源臂基因片段；
[0023]
[3]以pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca质粒为模板，pcr扩增p
43-mtsase基因片段；
[0024]
[4]以pmad质粒为模板，pcr扩增获得红霉素em抗性基因片段；
[0025]
[5]以pdg1730质粒为模板，反向pcr扩增获得pdglipa线性化载体基因片段；
[0026]
[6]利用无缝克隆技术，分别将步骤[1]中的lipa上游同源臂基因片段、步骤[3]中p
43-mtsase基因片段、步骤[4]中的红霉素em抗性基因片段、步骤[2]中的lipa下游同源臂基因片段、步骤[5]中的pdglipa线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌lipa位点整合质粒pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa。
[0027]
步骤4、构建枯草芽孢杆菌egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls，包括如下步骤：
[0028]
a以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增egls上游同源臂基因片段；
[0029]
b以枯草芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增egls下游同源臂基因片段；
[0030]
c以pht01-p
43-mthase质粒为模板，pcr扩增p
43-mthase基因片段；
[0031]
d以pma5质粒为模板，pcr扩增获得卡那霉素km抗性基因片段；
[0032]
e以pdg1730质粒为模板，反向pcr扩增获得pdgegls线性化载体基因片段；
[0033]
f利用无缝克隆技术，分别将步骤a中的egls上游同源臂基因片段、步骤c中的p
43-mthase基因片段、步骤d中的卡那霉素km抗性基因片段、步骤b中的egls下游同源臂基因片段、步骤e中的pdgegls线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls。
[0034]
步骤5、构建枯草芽孢杆菌amye单位点整合菌株bacillus subtilis/amye::p
43-mtsase：
[0035]
将步骤1构建的pdg-amye-p
43-mtsase-amye质粒转化进b.subtilis wb800n中，制得amye单位点整合菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase；
[0036]
步骤6、构建枯草芽孢杆菌amye和laca双位点整合菌株bacillus subtilis/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase：
[0037]
将步骤2构建的pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca质粒转化进b.subtilis wb800n/
amye::p
43-mtsase中，制得amye、laca双位点整合菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase；
[0038]
步骤7、构建枯草芽孢杆菌amye、laca和lipa三位点整合菌株bacillus subtilis/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase：
[0039]
将步骤3构建pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa质粒转化进b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase中，制得amye、laca、lipa三位点整合菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase；
[0040]
步骤8、构建枯草芽孢杆菌amye、laca、lipa和egls四位点整合菌株bacillus subtilis/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase：
[0041]
将步骤4构建的pdg-egls-p
43-mthase-km-egls质粒转化进b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase中，制得amye、laca、lipa、egls四位点整合菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase，即异源同体表达mtsase和mthase重组枯草芽孢杆菌。
[0042]
根据本发明优选的：所述步骤(1)中启动子p
43
基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0043]
p
43-f：5
’‑
gatcggatccagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0044]
p
43-mtsase-r：5
’‑
ctgatatcatgtgtacattcctctcttacctataatgg-3’；
[0045]
根据本发明优选的，所述步骤(2)中麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0046]
mtsase-p
43-f：5
’‑
gaatgtacacatgatatcagcaacctacagattaca-3’；
[0047]
mtsase-r：5
’‑
gaattcttagtggtggtggtggtggtgcattctaactagtatcctag g-3’；
[0048]
根据本发明优选的，所述步骤(3)中pdgamye线性化载体基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0049]
pdg-f：5
’‑
caccaccaccaccaccactaaggattcctgcagccctggc-3’；
[0050]
pdg-r：5
’‑
gcacgaagctggatccgatcagaccagtttttaat-3’；
[0051]
根据本发明优选的：所述步骤
①
中laca上游同源臂基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0052]
laca-front-f：5
’‑
ttcaagaatttgtgatgtcaaagcttgaaaaaac-3’；
[0053]
laca-front-r：5
’‑
gcacgaagctgttatgccaattgaccgcg-3’；
[0054]
根据本发明优选的，所述步骤
②
中laca下游同源臂基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0055]
laca-back-f：5
’‑
aataacttaacggacagcgttctctatttccaat-3’；
[0056]
laca-back-r：5
’‑
gcagacaatataatgtgtgtttacgacaattct-3’；
[0057]
根据本发明优选的，所述步骤
③
中p
43-mtsase基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0058]
p
43-mtsase-f1：5
’‑
ttggcataacagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0059]
mtsase-p
43-r1：5
’‑
tcacgacgttttagtggtggtggtggtggtgcattctaactagt
[0060]
atcctagg-3’；
[0061]
根据本发明优选的，所述步骤
④
中氯霉素cm抗性基因片段的pcr扩增引物核苷酸
序列如下：
[0062]
cm-f：5
’‑
ccaccactaaaacgtcgtgactgggaaaaccctggc-3’；
[0063]
cm-r：5
’‑
acgctgtccgttaagttattggtatgactggttttaag-3’；
[0064]
根据本发明优选的，所述步骤
⑤
中pdglaca线性化载体基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0065]
pdglaca-f：5
’‑
acacacattatattgtctgcatttgcgccgg-3’；
[0066]
pdglaca-r：5
’‑
tgacatcacaaattcttgaagacgaaagggc-3’；
[0067]
根据本发明优选的：所述步骤[1]中lipa上游同源臂基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0068]
lipa-front-f：5
’‑
ttcaagaattttcatctgtgccatacgacag-3’；
[0069]
lipa-front-r：5
’‑
gcacgaagctcgccatctttctgatcgtc-3’；
[0070]
根据本发明优选的，所述步骤[2]中laca下游同源臂基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0071]
lipa-back-f：5
’‑
tttttgtgaagcgaacaacgtggatattatggc-3’；
[0072]
lipa-back-r：5
’‑
gcagacaatatttgaataagaatcatgatctcacct-3’；
[0073]
根据本发明优选的，所述步骤[3]中p
43-mtsase基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0074]
p
43-mtsase-f2：5
’‑
aaagatggcgagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0075]
mtsase-p
43-r2：5
’‑
tttaacgactttagtggtggtggtggtggtgcattctaactagt atcctagg-3’；
[0076]
根据本发明优选的，所述步骤[4]中红霉素em抗性基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0077]
em-f：5
’‑
ccaccactaaagtcgttaaaccgtgtgctct-3’；
[0078]
em-r：5
’‑
cgttgttcgcttcacaaaaaataggcacacgaaaa-3’；
[0079]
根据本发明优选的，所述步骤[5]中pdglipa线性化载体基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0080]
pdglipa-f：5
’‑
cttattcaaatattgtctgcatttgcgccgg-3’；
[0081]
pdglipa-r：5
’‑
cacagatgaaaattcttgaagacgaaagggc-3’；
[0082]
根据本发明优选的：所述步骤a中egls上游同源臂基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0083]
egls-front-f：5
’‑
ttcaagaattctttcatcgcagtcgcaa-3’；
[0084]
egls-front-r：5
’‑
gcacgaagctcacggacgggttgtcaatat-3’；
[0085]
根据本发明优选的，所述步骤b中egls下游同源臂基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0086]
egls-back-f：5
’‑
ggggattttaaaagataaacccacacaggaaaa-3’；
[0087]
egls-back-r：5
’‑
gcagacaataaaatcgcttttttattttgttgctga-3’；
[0088]
根据本发明优选的，所述步骤c中p
43-mthase基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0089]
p
43-mthase-f：5
’‑
cccgtccgtgagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0090]
mthase-p
43-r：5
’‑
ttcaatccttttatcagtggtggtggtggtggtgttctaattgat atacc-3’；
[0091]
根据本发明优选的，所述步骤d中卡那霉素km抗性基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0092]
km-f：5
’‑
accactgataaaaggattgaaggatgcttagga-3’；
[0093]
km-r：5
’‑
gtttatcttttaaaatcccctttcattttctaatgtaaatct-3’；
[0094]
根据本发明优选的，所述步骤e中pdgegls线性化载体基因片段的pcr扩增引物核苷酸序列如下：
[0095]
pdgegls-f：5
’‑
aaagcgattttattgtctgcatttgcgccgg-3’；
[0096]
pdgegls-r：5
’‑
gcgatgaaagaattcttgaagacgaaagggc-3’；
[0097]
根据本发明优选的，所述步骤1中pcr扩增体系如下：
[0098]
10μmol/l上游引物2.5μl，10μmol/l下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，加ddh2o到50μl；
[0099]
扩增程序如下：
[0100]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
[0101]
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时dna聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
[0102]
根据本发明优选的，所述步骤1中的整合质粒构建方法如下，总体积为20μl：
[0103]
pcr扩增获得的各段基因片段0.03pmol、反向pcr扩增获得的线性化载体基因片段0.03pmol、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，得到整合质粒。
[0104]
根据本发明优选的，所述步骤5中，将步骤1构建的pdg-amye-p
43-mtsase-amye质粒转入b.subtilis wb800n中，整合到基因组中的amye位点，筛选后得到amye单位点整合型重组菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase。
[0105]
进一步优选的，所述筛选是将转化子涂布于含100μg/ml壮观霉素抗性的lb平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有100μg/ml壮观霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。
[0106]
根据本发明优选的，所述步骤2中pcr扩增体系如下：
[0107]
10μmol/l上游引物2.5μl，10μmol/l下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，加ddh2o到50μl；
[0108]
扩增程序如下：
[0109]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
[0110]
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时dna聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
[0111]
根据本发明优选的，所述步骤2中的整合质粒构建方法如下，总体积为20μl：
[0112]
pcr扩增获得的各段基因片段0.03pmol、反向pcr扩增获得的线性化载体基因片段0.03pmol、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min；将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，得到整合质粒。
[0113]
根据本发明优选的，所述步骤6中，将步骤2构建的pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca质粒转入b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase中，整合到基因组中的laca位点，筛选后得到amye、laca双位点整合型重组菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase。
[0114]
进一步优选的，所述筛选是将转化子涂布于含15μg/ml氯霉素抗性的lb平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有15μg/ml氯霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。
[0115]
根据本发明优选的，所述步骤3中pcr扩增体系如下：
[0116]
10μmol/l上游引物2.5μl，10μmol/l下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，加ddh2o到50μl；
[0117]
扩增程序如下：
[0118]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
[0119]
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时dna聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
[0120]
根据本发明优选的，所述步骤3中的整合质粒构建方法如下，总体积为20μl：
[0121]
pcr扩增获得的各段基因片段0.03pmol、反向pcr扩增获得的线性化载体基因片段0.03pmol、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，得到整合质粒。
[0122]
根据本发明优选的，所述步骤7中，将步骤3构建的pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa质粒转入b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase中，整合到基因组中的lipa位点，筛选后得到amye、laca、lipa三位点整合型重组菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase。
[0123]
进一步优选的，所述筛选是将转化子涂布于含5μg/ml红霉素抗性的lb平板，37℃培养12h，用牙签挑取红霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有5μg/ml红霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。
[0124]
根据本发明优选的，所述步骤4中pcr扩增体系如下：
[0125]
10μmol/l上游引物2.5μl，10μmol/l下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，加ddh2o到50μl；
[0126]
扩增程序如下：
[0127]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
[0128]
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时dna聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
[0129]
根据本发明优选的，所述步骤4中的整合质粒构建方法如下，总体积为20μl：
[0130]
pcr扩增获得的各段基因片段0.03pmol、反向pcr扩增获得的线性化载体基因片段0.03pmol、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，得到整合质粒。
[0131]
根据本发明优选的，所述步骤8中，将步骤4构建的pdg-egls-p
43-mthase-km-egls质粒转入b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase中，整合到基因组中的egls位点，筛选后得到amye、laca、lipa、egls四位点整合型重组菌株b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase。
[0132]
进一步优选的，所述筛选是将转化子涂布于含100μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃培养12h，用牙签挑取卡那霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有100μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。
[0133]
按照上述方法构建的异源同体表达mtsase和mthase重组枯草芽孢杆菌在发酵生产海藻糖中的应用。
[0134]
有益效果：
[0135]
本发明采用枯草芽孢杆菌多位点基因组整合的方式，构建amye、laca、lipa、egls四位点整合型重组菌株，可有效提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase在枯草芽孢杆菌中的高效表达，同时实现麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶mthase在枯草芽孢杆菌中的同源异体表达，并进行双酶转化法生产海藻糖。通过实际发酵发现mtsase和mthase在枯草芽孢杆菌中异源同体协同表达，达到mtsase和mthase最适催化比例，转化生产海藻糖，海藻糖的转化率提高至79.7％。
附图说明
[0136]
图1为p
43-mtsase基因片段(a)、laca-p
43-mtsase-cm-laca基因片段(b)、lipa-p
43-mtsase-em-lipa基因片段(c)、egls-p
43-mthase-km-egls基因片段(d)的琼脂糖凝胶电泳图。
[0137]
具体实施方法
[0138]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂、质粒及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中涉及的步骤及方法，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
[0139]
实施例中涉及的枯草芽孢杆菌基因组均是从枯草芽孢杆菌b.subtilis wb800n中按照常规方法提取得到的，从其他枯草芽孢杆菌中提取的枯草芽孢杆菌基因组亦可。
[0140]
实施例1：构建重组质粒
[0141]
1.amye位点整合质粒pdg-amye-p
43-mtsase-amye构建
[0142]
(1)克隆得到组成型启动子p
43
基因片段
[0143]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增启动子p
43
基因片段；
[0144]
所述启动子p
43
基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0145]
p
43-f：5
’‑
gatcggatccagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0146]
p
43-mtsase-r：5
’‑
ctgatatcatgtgtacattcctctcttacctataatgg-3’；
[0147]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0148]
10μmol/l上游引物p
43-f 2.5μl，10μmol/l下游引物p
43-mtsase-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0149]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0150]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0151]
(2)克隆得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段
[0152]
以嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)atcc 33909基因组为模板，设计引物进行pcr扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段；
[0153]
所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0154]
mtsase-p
43-f：5
’‑
gaatgtacacatgatatcagcaacctacagattaca-3’；
[0155]
mtsase-r：5
’‑
gaattcttagtggtggtggtggtggtgcattctaactagtatcctag g-3’；
[0156]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0157]
10μmol/l上游引物mtsase-p
43-f 2.5μl，10μmol/l下游引物mtsase-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0158]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0159]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 10sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0160]
(3)克隆得到pdgamye线性化载体基因片段
[0161]
以pdg1730质粒为模板，设计引物进行反向pcr扩增pdgamye线性化载体基因片段；
[0162]
所述pdgamye线性化载体基因片段的反向pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0163]
pdg-f：5
’‑
caccaccaccaccaccactaaggattcctgcagccctggc-3’；
[0164]
pdg-r：5
’‑
gcacgaagctggatccgatcagaccagtttttaat-3’；
[0165]
所述反向pcr扩增反应体系如下：
[0166]
10μmol/l上游引物pdg-f 2.5μl，10μmol/l下游引物pdg-r 2.5μl，pdg1730质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0167]
上述反向pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0168]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min 40sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0169]
(4)利用无缝克隆技术，加入0.03pmol启动子p
43
基因片段、0.03pmol麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase基因片段、0.03pmol pdgamye线性化载体基因片段、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，将制得的amye位点整合质粒命名为pdg-amye-p
43-mtsase-amye，其中p
43-mtsase的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0170]
2.laca位点整合质粒pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca构建
[0171]
(1)克隆得到laca上游同源臂基因片段
[0172]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增laca上游同源臂基因片段；
[0173]
所述laca上游同源臂基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0174]
laca-front-f：5
’‑
ttcaagaatttgtgatgtcaaagcttgaaaaaac-3’；
[0175]
laca-front-r：5
’‑
gcacgaagctgttatgccaattgaccgcg-3’；
[0176]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0177]
10μmol/l上游引物laca-front-f 2.5μl，10μmol/l下游引物laca-front-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0178]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0179]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0180]
(2)克隆得到laca下游同源臂基因片段
[0181]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增laca下游同源臂基因片段；
[0182]
所述laca下游同源臂基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0183]
laca-back-f：5
’‑
aataacttaacggacagcgttctctatttccaat-3’；
[0184]
laca-back-r：5
’‑
gcagacaatataatgtgtgtttacgacaattct-3’；
[0185]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0186]
10μmol/l上游引物laca-back-f 2.5μl，10μmol/l下游引物laca-back-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0187]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0188]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0189]
(3)克隆得到p
43-mtsase基因片段
[0190]
以pdg-amye-p
43-mtsase-amye质粒为模板，设计引物进行pcr扩增p
43-mtsase基因片段；
[0191]
所述p
43-mtsase基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0192]
p
43-mtsase-f1：5
’‑
ttggcataacagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0193]
mtsase-p
43-r1：5
’‑
tcacgacgttttagtggtggtggtggtggtgcattctaactag tatcctagg-3’；
[0194]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0195]
10μmol/l上游引物p
43-mtsase-f1 2.5μl，10μmol/l下游引物mtsase-p
43-r1 2.5μl，pdg-amye-p
43-mtsase-amye质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0196]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0197]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0198]
(4)克隆得到氯霉素cm抗性基因片段
[0199]
以pht01质粒为模板，设计引物进行pcr扩增氯霉素cm抗性基因片段；
[0200]
所述氯霉素cm抗性基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0201]
cm-f：5
’‑
ccaccactaaaacgtcgtgactgggaaaaccctggc-3’；
[0202]
cm-r：5
’‑
acgctgtccgttaagttattggtatgactggttttaag-3’；
[0203]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0204]
10μmol/l上游引物cm-f 2.5μl，10μmol/l下游引物cm-r 2.5μl，pht01质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0205]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0206]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0207]
(5)克隆得到pdglaca线性化载体基因片段
[0208]
以pdg1730质粒为模板，设计引物进行反向pcr扩增pdglaca线性化载体基因片段；
[0209]
所述pdglaca线性化载体基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0210]
pdglaca-f：5
’‑
acacacattatattgtctgcatttgcgccgg-3’；
[0211]
pdglaca-r：5
’‑
tgacatcacaaattcttgaagacgaaagggc-3’；
[0212]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0213]
10μmol/l上游引物pdglaca-f 2.5μl，10μmol/l下游引物pdglaca-r 2.5μl，pdg1730质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0214]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0215]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0216]
(6)利用无缝克隆技术，加入0.03pmol laca上游同源臂基因片段、0.03pmol p
43-mtsase基因片段、0.03pmol氯霉素cm抗性基因片段、0.03pmol laca下游同源臂基因片段、0.03pmol pdglaca线性化载体基因片段、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，将制得的laca位点整合质粒命名为pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca，其中laca-p
43-mtsase-cm-laca的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0217]
3.lipa位点整合质粒pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa构建
[0218]
(1)克隆得到lipa上游同源臂基因片段
[0219]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增lipa上游同源臂基因片段；
[0220]
所述lipa上游同源臂基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0221]
lipa-front-f：5
’‑
ttcaagaattttcatctgtgccatacgacag-3’；
[0222]
lipa-front-r：5
’‑
gcacgaagctcgccatctttctgatcgtc-3’；
[0223]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0224]
10μmol/l上游引物lipa-front-f 2.5μl，10μmol/l下游引物lipa-front-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0225]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0226]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0227]
(2)克隆得到lipa下游同源臂基因片段
[0228]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增lipa下游同源臂基因片段；
[0229]
所述lipa下游同源臂基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0230]
lipa-back-f：5
’‑
tttttgtgaagcgaacaacgtggatattatggc-3’；
[0231]
lipa-back-r：5
’‑
gcagacaatatttgaataagaatcatgatctcacct-3’；
[0232]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0233]
10μmol/l上游引物lipa-back-f 2.5μl，10μmol/l下游引物lipa-back-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0234]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0235]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0236]
(3)克隆得到p
43-mtsase基因片段
[0237]
以pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca质粒为模板，设计引物进行pcr扩增p
43-mtsase基因片段；
[0238]
所述p
43-mtsase基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0239]
p
43-mtsase-f2：5
’‑
aaagatggcgagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0240]
mtsase-p
43-r2：5
’‑
tttaacgactttagtggtggtggtggtggtgcattctaactagt atcctagg-3’；
[0241]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0242]
10μmol/l上游引物p
43-mtsase-f2 2.5μl，10μmol/l下游引物mtsase-p
43-r2 2.5μl，pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0243]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0244]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0245]
(3)克隆得到红霉素em抗性基因片段
[0246]
以pmad质粒为模板，设计引物进行pcr扩增红霉素em抗性基因片段；
[0247]
所述红霉素em抗性基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0248]
em-f：5
’‑
ccaccactaaagtcgttaaaccgtgtgctct-3’；
[0249]
em-r：5
’‑
cgttgttcgcttcacaaaaaataggcacacgaaaa-3’；
[0250]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0251]
10μmol/l上游引物em-f 2.5μl，10μmol/l下游引物em-r 2.5μl，pmad质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0252]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0253]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0254]
(5)克隆得到pdglipa线性化载体基因片段
[0255]
以pdg1730质粒为模板，设计引物进行反向pcr扩增pdglipa线性化载体基因片段；
[0256]
所述pdglipa线性化载体基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0257]
pdglipa-f：5
’‑
cttattcaaatattgtctgcatttgcgccgg-3’；
[0258]
pdglipa-r：5
’‑
cacagatgaaaattcttgaagacgaaagggc-3’；
[0259]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0260]
10μmol/l上游引物pdglipa-f 2.5μl，10μmol/l下游引物pdglipa-r 2.5μl，pdg1730质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0261]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0262]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min 30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0263]
(6)利用无缝克隆技术，加入0.03pmol lipa上游同源臂基因片段、0.03pmol p
43-mtsase基因片段、0.03pmol红霉素em抗性基因片段、0.03pmol lipa下游同源臂基因片段、0.03pmol pdglipa线性化载体基因片段、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，将制得的lipa位点整合质粒命名为pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa，其中，lipa-p
43-mtsase-em-lipa的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0264]
4.egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls构建
[0265]
(1)克隆得到egls上游同源臂基因片段
[0266]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增egls上游同源臂基因片段；
[0267]
所述egls上游同源臂基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0268]
egls-front-f：5
’‑
ttcaagaattctttcatcgcagtcgcaa-3’；
[0269]
egls-front-r：5
’‑
gcacgaagctcacggacgggttgtcaatat-3’；
[0270]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0271]
10μmol/l上游引物egls-front-f 2.5μl，10μmol/l下游引物egls-front-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0272]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0273]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0274]
(2)克隆得到egls下游同源臂基因片段
[0275]
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行pcr扩增egls下游同源臂基因片段；
[0276]
所述egls下游同源臂基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0277]
egls-back-f：5
’‑
ggggattttaaaagataaacccacacaggaaaa-3’；
[0278]
egls-back-r：5
’‑
gcagacaataaaatcgcttttttattttgttgctga-3’；
[0279]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0280]
10μmol/l上游引物egls-back-f 2.5μl，10μmol/l下游引物egls-back-r 2.5μl，基因组模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0281]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0282]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0283]
(3)克隆得到p
43-mthase基因片段
[0284]
以pht01-p
43-mthase质粒为模板，设计引物进行pcr扩增p
43-mthase基因片段；
[0285]
所述p
43-mthase基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0286]
p
43-mthase-f：5
’‑
cccgtccgtgagcttcgtgcatgcaggc-3’；
[0287]
mthase-p
43-r：5
’‑
ttcaatccttttatcagtggtggtggtggtggtgttctaattgat atacc-3’；
[0288]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0289]
10μmol/l上游引物p
43-mthase-f 2.5μl，10μmol/l下游引物mthase-p
43-r 2.5μl，pht01-p
43-mthase质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0290]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0291]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0292]
(4)克隆得到卡那霉素km抗性基因片段
[0293]
以pma5质粒为模板，设计引物进行pcr扩增卡那霉素km抗性基因片段；
[0294]
所述卡那霉素km抗性基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0295]
km-f：5
’‑
accactgataaaaggattgaaggatgcttagga-3’；
[0296]
km-r：5
’‑
gtttatcttttaaaatcccctttcattttctaatgtaaatct-3’；
[0297]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0298]
10μmol/l上游引物km-f 2.5μl，10μmol/l下游引物km-r 2.5μl，pma5质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0299]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0300]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸45sec，35个循环；72℃延伸5min；
[0301]
(5)克隆得到pdgegls线性化载体基因片段
[0302]
以pdg1730质粒为模板，设计引物进行反向pcr扩增pdgegls线性化载体基因片段；
[0303]
所述pdgegls线性化载体基因片段的pcr扩增引物的核苷酸序列如下：
[0304]
pdgegls-f：5
’‑
aaagcgattttattgtctgcatttgcgccgg-3’；
[0305]
pdgegls-r：5
’‑
gcgatgaaagaattcttgaagacgaaagggc-3’；
[0306]
所述pcr扩增反应体系如下：
[0307]
10μmol/l上游引物pdgegls-f 2.5μl，10μmol/l下游引物pdgegls-r 2.5μl，pdg1730质粒模板2.5μl，2
×
phanta max master mix 25μl，用ddh2o补足至50μl；
[0308]
上述pcr扩增反应按照如下程序进行：
[0309]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min 30sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0310]
(6)利用无缝克隆技术，加入0.03pmol egls上游同源臂基因片段、0.03pmol p
43-mthase基因片段、0.03pmol卡那霉素km抗性基因片段、0.03pmol egls下游同源臂基因片段、0.03pmol pdgegls线性化载体基因片段、4μl 5
×
ce multis buffer、2μl exnase multis，加ddh2o到20μl；将反应体系置于37℃反应30min，将获得的重组产物转化于大肠杆菌中，鉴定成功并测序正确后，将制得的egls位点整合质粒命名为pdg-egls-p
43-mthase-km-egls，其中，egls-p
43-mthase-km-egls的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0311]
实施例2：b.subtilis wb800n感受态细胞的制备
[0312]
挑取新鲜lb固体培养基表面的b.subtilis wb800n单菌落于5ml lb液体培养基
中，培养12h；取1ml培养12h的培养物接入50ml gm培养基(gm培养基：lb+0.5m山梨醇)中，37℃振荡培养至od
600
为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm、4℃离心8min，收集菌体；用20ml预冷的etm培养基(etm培养基：0.5m山梨醇+0.5m甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm、4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次；将洗涤后的菌体重悬于500μl etm培养基中，得b.subtilis wb800n感受态细胞，分装于ep管中，每管分装60μl。
[0313]
实施例3：
[0314]
将实施例1制备的amye位点整合质粒pdg-amye-p
43-mtsase-amye转入实施例2制备的b.subtilis wb800n感受态细胞中，获得amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase，具体方法为：
[0315]
将6μl pdg-amye-p
43-mtsase-amye质粒加入到60μl b.subtilis wb800n感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500v、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1ml 37℃预热的rm培养基(rm培养基：lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100μg/ml壮观霉素的lb平板上，37℃倒置培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有100μg/ml壮观霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。筛选的阳性转化子为amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase。
[0316]
实施例4：
[0317]
将实施例1制备的laca位点整合质粒pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca转入实施例3制备的amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase中，获得amye、laca双位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase，具体方法为：
[0318]
将6μl pdg-laca-p
43-mtsase-cm-laca质粒加入到60μl b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase感受态细胞中(b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase感受态细胞的制备与实施例2中b.subtilis wb800n感受态细胞的制备方法相同)，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500v、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1ml 37℃预热的rm培养基(rm培养基：lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含15μg/ml氯霉素的lb平板上，37℃倒置培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有15μg/ml氯霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。筛选的阳性转化子为amye、laca双位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase。
[0319]
实施例5：
[0320]
将实施例1制备的lipa位点整合质粒pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa转入实施例4制备的amye、laca双位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase中，获得amye、laca、lipa三位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase，具体方法为：
[0321]
将6μl pdg-lipa-p
43-mtsase-em-lipa质粒加入到60μl b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase感受态细胞中(b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase感受态细胞的制备与实施例2中b.subtilis wb800n感受态细胞
的制备方法相同)，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500v、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1ml 37℃预热的rm培养基(rm培养基：lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含5μg/ml红霉素的lb平板上，37℃倒置培养12h，用牙签挑取红霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有5μg/ml红霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。筛选的阳性转化子为amye、laca、lipa三位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase。
[0322]
实施例6：
[0323]
将实施例1制备的egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls转入实施例5制备的amye、laca、lipa三位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase中，获得amye、laca、lipa、egls四位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase，具体方法为：
[0324]
将6μl pdg-egls-p
43-mthase-km-egls质粒加入到60μl b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase感受态细胞中(b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase感受态细胞的制备与实施例2中b.subtilis wb800n感受态细胞的制备方法相同)，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500v、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1ml 37℃预热的rm培养基(rm培养基：lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100μg/ml卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养12h，用牙签挑取卡那霉素抗性的lb平板上的转化子，分别接种到含有100μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，以菌液为模板进行菌落pcr扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，得到阳性转化子。筛选的阳性转化子为amye、laca、lipa、egls四位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase。
[0325]
实施例7：实施例6制备的阳性重组菌的鉴定
[0326]
将上述阳性重组菌落接种到含有100μg/ml壮观霉素、15μg/ml氯霉素、5μg/ml红霉素、100μg/ml卡那霉素lb液体培养基中37℃培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组dna，以获得的基因组dna为模板，分别对应的p
43-f/mtsase-r、laca-front-f/laca-back-r、lipa-front-f/lipa-back-r、egls-front-f/egls-back-r为引物进行pcr扩增。
[0327]
所述pcr扩增体系为20μl：
[0328]
10μmol/l上游引物1μl；10μmol/l下游引物1μl；基因组模板1μl；2
×
phanta max master mix 10μl；用ddh2o补足至20μl；
[0329]
所述pcr扩增程序如下：
[0330]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；
[0331]
琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，琼脂糖凝胶电泳证明外源片段p
43-mtsase分别插入枯草芽孢杆菌amye、laca、lipa基因位点，外源片段p
43-mthase插入枯草芽孢杆菌egls基因位点，将阳性重组菌命名为b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/
lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase。
[0332]
实施例8：
[0333]
将实施例1制备的egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls转入实施例2制备的b.subtilis wb800n感受态细胞中，获得egls单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase，具体方法为：
[0334]
将6μl pdg-egls-p
43-mthase-km-egls质粒加入到60μl b.subtilis wb800n感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500v、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1ml 37℃预热的rm培养基(rm培养基：lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100μg/ml卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养，筛选抗卡那霉素的菌株为egls单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase。
[0335]
实施例9：阳性重组菌的发酵
[0336]
a、将实施例7阳性重组菌接种于lb固体培养基中，37℃恒温培养12h；
[0337]
b、将lb固体培养基中的重组菌接种于lb液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养12h，制得初始种子液；
[0338]
c、将步骤b制得的初始种子液按体积百分比1％的比例转接到tb液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养10h，制得接种种子液；
[0339]
d、将步骤c制得的接种种子液按体积百分比10％的比例转接到50l发酵培养基中，在转速500rpm，温度37℃，发酵48h；将发酵液利用陶瓷膜进行过滤，即得去除菌体的发酵液清液。
[0340]
培养基：
[0341]
lb固体培养基：蛋白胨1g/l，酵母浸粉0.5g/l，nacl 1g/l，琼脂粉2g/l，溶剂水；
[0342]
lb液体培养基：蛋白胨1g/l，酵母浸粉0.5g/l，nacl 1g/l，溶剂水，ph 7.0；
[0343]
tb液体培养基：胰蛋白胨12g/l，酵母浸粉24g/l，甘油4ml/l，kh2po
4 2.4g/l，k2hpo416.5g/l，溶剂水；
[0344]
发酵培养基：胰蛋白胨12g/l，酵母浸粉24g/l，蔗糖12g/l，kh2po
4 0.6g/l，k2hpo44g/l，溶剂水。
[0345]
上述阳性重组菌进行发酵表达，并进行海藻糖转化实验。
[0346]
实施例10：海藻糖转化实验
[0347]
将实施例9中获得的发酵液经高压匀浆破碎机破碎后得粗酶液用于转化海藻糖。向恒温反应器中加入de值为8.8麦芽糊精，普鲁兰酶5u/g麦芽糊精，环糊精葡萄糖基转移酶cgtase1u/g麦芽糊精，加入粗酶液，控制粗酶液中mthase添加量为35u/g麦芽糊精，控制转化温度为60℃、ph为6.0，转化时间为48h；转化结束后添加糖化酶，将残留的杂糖转化为葡萄糖。利用高效液相色谱检测海藻糖的含量，计算海藻糖转化率。
[0348][0349]
式中：y—海藻糖转化率(％)
[0350]
m1—海藻糖质量(g)
[0351]
m2—麦芽糊精质量(g)
[0352]
对比例1
[0353]
分别将实施例3中获得的amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase和实施例8中获得的egls单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase，采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法，将b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase和b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase获得的粗酶液按1:1质量比混合进行海藻糖转化。
[0354]
对比例2
[0355]
分别将实施例3中获得的amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase和实施例8中获得的egls单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase，采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法，将b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase和b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase获得的粗酶液按2:1质量比混合进行海藻糖转化。
[0356]
对比例3
[0357]
分别将实施例3中获得的amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase和实施例8中获得的egls单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase，采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法，将b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase和b.subtilis wb800n/egls::p
43-mthase获得的粗酶液按3:1质量比混合进行海藻糖转化。
[0358]
对比例4
[0359]
将实施例1中的egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls转入将实施例3中的amye单位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase中，制得阳性amye、egls双位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase。
[0360]
采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法进行海藻糖转化。
[0361]
对比例5
[0362]
将实施例1中的egls位点整合质粒pdg-egls-p
43-mthase-km-egls转入将实施例4中的amye、laca双位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase中，制得阳性amye、laca、egls三位点整合重组菌b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/egls::p
43-mthase。
[0363]
采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法进行海藻糖转化。
[0364]
对比例6
[0365]
改变mthase基因的插入位点，将mthase基因插入到amye位点：按照实施例1的方法构建相应的位点整合质粒，按照实施例2-6构建相应的重组菌，构建重组菌时，整合质粒的位点插入顺序依次为amye位点、laca位点、lipa位点、egls位点；得到的重组菌为：b.subtilis wb800n/amye::p
43-mthase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mtsase；
[0366]
采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法进行海藻糖转化。
[0367]
对比例7
[0368]
改变mthase基因的插入位点，将mthase基因插入到laca位点：按照实施例1的方法构建相应的位点整合质粒，按照实施例2-6构建相应的重组菌，构建重组菌时，整合质粒的位点插入顺序依次为amye位点、laca位点、lipa位点、egls位点；得到的重组菌为：b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mthase/lipa::p
43-mtsase/egls::p
43-mtsase；
[0369]
采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法进行海藻糖转化。
[0370]
对比例8
[0371]
改变mthase基因的插入位点，将mthase基因插入到lipa位点：按照实施例1的方法构建相应的位点整合质粒，按照实施例2-6构建相应的重组菌，构建重组菌时，整合质粒的位点插入顺序依次为amye位点、laca位点、lipa位点、egls位点；得到的重组菌为：b.subtilis wb800n/amye::p
43-mtsase/laca::p
43-mtsase/lipa::p
43-mthase/egls::p
43-mtsase。
[0372]
采用实施例9的发酵方法对阳性重组菌进行发酵表达；采用实施例10的海藻糖转化方法进行海藻糖转化。
[0373]
结果与分析：
[0374]
检测实施例10和对比例1-8阳性重组菌双酶的转化率。
[0375]
检测方法：
[0376]
通过高效液相色谱测定反应液(糖化液)中所生成的海藻糖的浓度，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃；流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1ml/min；检测器为示差检测器；检测时间为20min。
[0377]
实施例10与对比例1-8涉及的不同组装形式的mtsase-mthase多酶复合体自组装模型及组装模块比例见表1。
[0378]
表1.实施例10与对比例1-9的组装模式及海藻糖转化率
[0379]
实验组mtsase和mthase表达形式mtsase/mthase海藻糖的转化率/％实施例10异源同体四位点整合3:179.7对比例1异源异体单位点整合1:149.5对比例2异源异体单位点整合2:171.2对比例3异源异体单位点整合3:180.3对比例4异源同体双位点整合1:148.7对比例5异源同体三位点整合2:169.8对比例6异源同体四位点整合3:172.4对比例7异源同体四位点整合3:176.9对比例8异源同体四位点整合3:174.8
[0380]
通过实施例10和对比例1-8的海藻糖转化率结果可以看出，无论是异源同体还是异源异体位点整合，当mtsase和mthase比例为3:1时，海藻糖的转化率都相对来说较高。当mtsase和mthase异源异体表达，并将mtsase和mthase比例为3:1混合进行海藻糖转化，海藻糖转化率为80.3％；当mtsase和mthase异源同体表达，整合位点不同，海藻糖的转化率也相
应改变，且mtsase和mthase比例为3:1进行海藻糖转化，海藻糖转化率依次为79.7％、72.4％、76.9％、74.8％。异源同体四位点整合，mthase插入位点不同，会影响了mthase的表达量和酶活，进而影响海藻糖的催化效率。通过将mtsase和mthase异源同体表达，可以减少发酵液的用量，降低生产成本。