一株高效解磷真菌塔巴雷斯坦拟棘壳孢PtWFY-1及其应用

et al.,2016)。此外，溶磷真菌可促进植物生长发育，进而提高植物对磷的吸收和利用。但到目前为止，溶磷真菌促进水稻磷吸收和生长的作用机理还不是十分明确。
5.拟棘壳孢属(pyrenochaetopsis gruyter,aveskamp&verkley,gen.nov)是由de gruyter et al.于2010年建立的一个新属，属于子囊菌门ascomycota，座囊菌纲dothideomycetes，格孢腔菌目pleosporales，拟棘壳孢科pyrenochaetopsidaceae(de gruyter et al.,2010；valenzuela-lopez et al.,2018)。虽然拟棘壳孢属2010年才建立，但其在稻田生态系统中广泛分布，是稻田生态系统最常见的微生物类型，约占稻田微生物种类的4.0％～6.6％(papizadeh et al.,2017；chen et al.,2020)。现有研究发现其具有多种生物学功能，例如，de gruyter et al.,(2010)的研究指出拟棘壳孢属真菌直接参与调节土壤碳循环中的土壤呼吸作用和土壤酶活性，并且对土壤难溶性碳(有机质等)具有较强的溶解能力；bai et al.,(2019)的研究报道拟棘壳孢属是影响土壤co2排放的一类很重要的真菌；与此同时，xun et al.,(2020)的研究指出，稻田土壤中拟棘壳孢属真菌的相对丰度与n2o的释放呈正相关关系，是影响n2o释放的主要微生物类型。此外，土壤有机碳水平、zn浓度、生物炭添加等也会影响稻田拟棘壳孢属真菌的分布和生态功能(zheng et al.,2016；chen et al.,2020)。但目前对稻田生态系统中拟棘壳孢属真菌的研究较少，具有溶磷功能的拟棘壳孢属真菌种类尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种具有高效解磷功能的塔巴雷斯坦拟棘壳孢(pyrenochaetopsis tabarestanensis)ptwfy-1菌株，该菌是一种新的解磷真菌，可用于制作土壤磷素活化剂，提高水稻磷素利用率，减少含磷化肥的使用，促进水稻生长。
7.本发明的第一个目的是提供一株解无机磷和有机磷的塔巴雷斯坦拟棘壳孢(pyrenochaetopsis tabarestanensis)ptwfy-1，其于2021年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称gdmcc，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为gdmcc no：61861。
8.本发明的第二个目的是提供塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在解无机磷和/或有机磷中的应用。
9.优选，所述的无机磷为ca3(po4)2、mg3(po4)2、磷矿粉，所述的有机磷是植酸钙。
10.优选，所述的塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1是塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1的菌饼和/或菌株发酵液。
11.本发明的第三个目的是提供塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在分泌有机酸中的应用。
12.本发明的第四个目的是提供塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在促进土壤磷溶解和水稻磷吸收中的应用。
13.本发明的第五个目的是提供塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在制备土壤磷素活化剂中的用途。
14.本发明的第六个目的是提供一种生物制剂，其含有塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1作为活性成分。
15.所述的生物制剂是解无机磷和有机磷、分泌有机酸、促进土壤磷溶解和水稻磷吸
收的微生物菌剂或微生物肥料，可以促进植物生长。
16.优选，所述的生物制剂是将塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在pdb培养液中培养获得。
17.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果
18.1.本发明提供的塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1为首次从广东省农业科学院水稻研究所大丰基地水稻品种五丰优615根际土壤中分离得到的，能很好地在水稻根系定殖；将其作为土壤磷素活化剂，对于水稻的生产和加工来说更加安全可靠；
19.2.本发明提供的塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1，对土壤多种无机磷源(磷酸钙ca3(po4)2、磷酸镁mg3(po4)2、磷矿粉)和有机磷源(植酸钙)都有溶解能力；
20.3.本发明提供的塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在溶磷过程中可以分泌17种有机酸，使发酵液ph降低，含量较高的有机酸为：α-酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、琥珀酸、柠康酸、5-羟甲基-2-呋喃甲酸，分泌有机酸的总量为3439.94ng
·
ml-1
；
21.4.本发明得到的塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1，培养条件要求低，而且该生物来源环保无毒性，对生态环境影响小；具有很好的开发应用前景。
22.pyrenochaetopsis tabarestanensis ptwfy-1于2021年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称gdmcc，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为gdmcc no：61861。
附图说明
23.图1是塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在燕麦培养基上的单菌落图，其中a为塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1正面形态特征，b为塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1背面形态特征，c为塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1产生的厚垣孢子，d为基于its rdna序列同源性构建的ptwfy-1菌株系统发育树。
24.图2是塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在pvk固体培养基上的溶磷特性结果。其中a分别为ptwfy-1菌株在添加ca3(po4)2和植酸钙的pvk固体培养基上产生的溶磷圈(培养72h)，b为ptwfy-1菌株在pvk固体培养条件下对ca3(po4)2和植酸钙的溶磷能力；
25.图3是塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在pvk液体培养条件下的溶磷特性结果。其中a为ptwfy-1菌株在pvk液体培养条件下对ca3(po4)2的溶磷效果，b为ptwfy-1菌株在pvk液体培养条件下对mg3(po4)2的溶磷效果，c为ptwfy-1菌株在pvk液体培养条件下对磷矿粉的溶磷效果，d为ptwfy-1菌株在pvk液体培养条件下对植酸钙的溶磷效果；
26.图4是塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1发酵液ph值变化，其中a为ptwfy-1菌株在ca3(po4)2发酵液中ph变化，b为ptwfy-1菌株在mg3(po4)2发酵液中ph变化，c为ptwfy-1菌株在磷矿粉发酵液中ph变化，d为ptwfy-1菌株在植酸钙发酵液中ph变化；
27.图5为塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1促进水稻磷吸收和土壤磷溶解的结果组图，其中a为不接菌与接菌对水稻植株磷含量的影响，b为不接菌与接菌对土壤磷含量的影响。control和ptwfy-1分别代表不接菌和接菌处理。
具体实施方式
28.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限
于此。
29.实施例1：塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1(pyrenochaetopsis tabarestanensis)的分离、纯化、鉴定和保藏
30.(1)取样：水稻根际土壤采集于广东省农业科学院水稻研究所大丰基地，装入干净的采样袋(瓶)中，做好标记，于4℃冰箱中保存备用。
31.(2)分离和纯化：称取100g水稻根际土壤，溶于100ml无菌水中，静置2h，将上清液采用10倍稀释法，制成10-1
～10-7
稀释菌悬液。分别取100μl涂布于pda(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)真菌培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养48h-72h。将真菌菌株挑出，纯化分离并多次传代培养，获得纯培养菌株ptwfy-1。
32.(3)鉴定：对上述分离纯化得到的纯培养菌株ptwfy-1进行真菌形态鉴定，并提取其dna作为模板，its rdna通用引物为引物，对its rdna核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段直接进行序列测定，根据测定结果得出溶磷促生真菌菌株的名称并保藏于菌种保藏中心。
33.菌株ptwfy-1的its rdna序列的扩增长度为442bp，经同源性比对，与塔巴雷斯坦拟棘壳孢的同源性高达99.77％，结合ptwfy-1菌株形态学特征，鉴定该菌株为pyrenochaetopsis属的一个菌株，命名为塔巴雷斯坦拟棘壳孢(pyrenochaetopsis tabarestanensis)ptwfy-1。
34.its rdna序列片段如下：
35.gtcttttgcgtaccgtatgtttcctcggcgggcttgcctgccggttggacattatcaaacctttttgtagttgcaatcagcgtcagaaaataataataattacaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgaaaagtagtgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccatggggcatgcctgttcgagcgtcattttgtaccctcaagcactgcttggtgttgggcgcttgtcctgcaaaggactcgcctgaaagcgattggcggccaacgtactggtggtagagcgcagcacaatttgcgtctttcccctctgcgttagcgtccatgaagcctatttcaacgtttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaac(seq id no.1所示)
36.塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在燕麦培养基上生长14d，直径50-60mm。菌丝灰褐色，绒状略带絮状，中央呈灰白色。具厚垣孢子(见图1)。
37.(4)保藏：将塔巴雷斯坦拟棘壳孢(pyrenochaetopsis tabarestanensis)ptwfy-1于2021年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称gdmcc，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为gdmcc no：61861。
38.实施例2塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1的溶磷特性分析
39.(1)pvk固体培养基的制备：葡萄糖10.0g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，(nh4)2so
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，mnso4·
4h2o 0.03g，feso4·
7h2o 0.03g，ca3(po4)2/植酸钙5.0g，琼脂粉18g，定容至1000ml，ph值调节为7.0-7.2，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。
40.(2)pvk液体培养基的制备：葡萄糖10.0g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，(nh4)2so
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，mnso4·
4h2o 0.03g，feso4·
7h2o 0.03g，ca3(po4)2/fepo4/al po4/mg3(po4)2/磷矿粉/植酸钙5.0g，定容至1000ml，ph值调节为7.0-7.2，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。
41.(3)真菌孢子悬浮液制备：将塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1菌株进行活化，将真菌
reaction monitoring，mrm)分析完成。获得不同样本的质谱分析数据后，对所有目标物的色谱峰进行积分，通过标准曲线进行定量分析。结果如表1所示。
52.表1
[0053][0054][0055]
结果分析：塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1在溶磷过程中可以分泌17种有机酸，含量较高的有机酸为：α-酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、琥珀酸、柠康酸、5-羟甲基-2-呋喃甲酸，分泌有机酸的总量为3439.94ng
·
ml-1
。
[0056]
实施例4塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1对水稻磷吸收和土壤磷溶解的影响
[0057]
(1)水稻种子的消毒和萌发：取适量扬稻六号水稻种子进行杀菌消毒，先用70％乙醇溶液浸泡1min，用灭菌水漂洗1次，用2.5％的次氯酸钠溶液浸泡，37℃振荡灭菌30min，用灭菌水清洗5～6次。将已清洗好的水稻种子放入铺有灭菌双层滤纸的无菌培养皿中，30℃避光培养3d，使种子萌发和露白。
[0058]
(2)盆栽基质的制备：采用体积比为3:1(v/v)的水稻土与沙子混合得到盆栽基质，然后在121℃灭菌20min，冷却按比例装入水稻盆中，每盆约需300g种植基质。
[0059]
(3)塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1菌液的制备：取单一菌落的溶磷促生真菌塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1菌株进行活化，将真菌孢子刮入无菌水中制成1.0
×
106cfu/ml的真菌孢子悬浮液。
[0060]
(4)水稻种植和指标测定：取6粒步骤(1)的水稻种子，用灭菌镊子夹入水稻盆中，将1.0
×
106cfu/ml真菌孢子悬浮液按装土质量的2％，以灌根的方式施入土壤，以不接菌培养基制成的悬浮液为对照。随后将水稻盆放入温度和光照保持在30℃、16h光照和24℃、8h黑暗左右的人工气候室中培养，一周后间苗，每盆留3株苗。水稻培养60d左右结束实验，测定水稻的磷含量和土壤总磷含量等指标。
[0061]
结果分析：盆栽控制实验的结果表明，塔巴雷斯坦拟棘壳孢ptwfy-1对水稻磷吸收和土壤总磷含量具有显著促进效应(见图5)。
[0062]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。