ZDHHC21基因突变动物模型的构建方法及其应用

本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于crispr/cas9技术的zdhhc21基因突变动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种神经系统退行性疾病，是老年痴呆中最常见的一种类型，其临床表现以记忆障碍为主要特征，通常伴有失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等表现；其典型病理特征是淀粉样蛋白沉积和神经原纤维缠结。ad疾病的致病机制尚不明确，并且尚无明显延缓或逆转疾病进程的干预和治疗手段。

2、动物模型是发病机制研究和新药研发的重要基础。目前，ad疾病的发病机制研究主要采用家族性ad致病基因突变转基因动物，例如，常用的单转基因动物模型tg2576小鼠、多转基因动物模型app/ps1小鼠、3×tg小鼠、5×fad小鼠等；这些动物模型所使用的app、psen1基因突变来自家族性ad，这些基因突变能够影响β-分泌酶、γ-分泌酶分解淀粉样前体蛋白作用，使aβ水平升高，或提高aβ42/aβ40比率，从而导致aβ蛋白沉积，进一步引发tau磷酸化、神经炎症、记忆能力下降等ad相关表型；所使用的mapt基因突变包括p301s和p301l，是来自家族性额颞叶痴呆患者，能够加速tau聚集，进而形成神经原纤维缠结样结构，导致记忆能力下降等认知障碍，这些mapt基因突变与家族性ad无关，虽然引起的病理和表型与ad疾病相似，但不能完全阐释ad的发生机制。除app、psen1这些家族性ad致病基因突变外，也有研究将bace1、trem2基因和apoeε4等位基因作为ad风险基因来构建ad动物模型，这些风险基因突变能够起到加速aβ生成或tau聚集的作用。尽管已报道app、psen1、psen2、trem2基因突变超过530个，中国家族性ad仍有超过80％的患者家系不携带这些已知致病基因突变，研究其他致病基因突变将利于解释这些家族性ad的发病机制，目前缺乏基于来自家族性ad的其他风险基因突变所构建的动物模型。

3、zdhhc21基因位于人9号染色体，编码棕榈酰转移酶21(zincfinger dhhc domain-containing protein,dhhc21)；zdhhc21蛋白上第209位氨基酸t向氨基酸s的突变(简称zdhhc21 t209s)是来自家族性ad的一个新致病基因突变，这一突变可以促进棕榈酰化和app剪切，使aβ生成增多，从而导致阿尔茨海默病的发生。目前，还没有任何关于zdhhc21基因突变的阿尔茨海默病模型的构建方法的报道，因此，开发zdhhc21基因突变的阿尔茨海默病模型以研究阿尔茨海默病的发生、发展机制并进行阿尔茨海默病的治疗药物筛选是当前情势所需。

4、crispr/cas9系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效。2013年，科学家首次报道crispr/cas9系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。crispr/cas9系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。目前尚未见到基于crispr/cas9系统构建zdhhc21基因突变动物模型的报道。

技术实现思路

1、发明目的

2、本发明的目的在于提供一种用于通过crispr-cas9系统、特异性靶向zdhhc21基因的sgrna，基于该sgrna的crispr-cas9基因打靶系统，及其在制备zdhhc21基因突变的细胞或动物模型中的应用，以及利用该sgrna或者该基因打靶系统通过crispr-cas9技术向zdhhc21基因中引入目的突变的方法，构建zdhhc21基因突变小鼠模型的方法，以及所构建的zdhhc21基因突变小鼠模型作为阿尔茨海默病模型在研究阿尔茨海默病的发生、发展机制或筛选阿尔茨海默病的治疗药物中的应用。

3、解决方案

4、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种用于通过crispr-cas9系统、特异性靶向zdhhc21基因的sgrna，所述sgrna对应的dna序列如下：

6、tcaaaggtagtcaaacagtatgg(即，seq id no：1)。

7、第二方面，本发明提供了一种用于构建zdhhc21基因突变的细胞或动物模型的crispr-cas9基因打靶系统，所述crispr-cas9基因打靶系统包括如上述第一方面所述的特异性靶向zdhhc21基因的sgrna、cas9 mrna和含有zdhhc21突变位点的donor dna序列。

8、在可行的实施方案中，所述zdhhc21基因突变为导致zdhhc21蛋白第209位氨基酸t→s的基因突变；

9、优选地，所述zdhhc21突变位点为zdhhc21基因第8号外显子中第4位核苷酸a→t的突变；

10、进一步优选地，所述含有zdhhc21突变位点的donor dna序列如下：

11、caatcgggtatcctcaaaggttgtaatcaaatgaaatagttcttggagagatgtttgatattttagtagttcactgatttttttatatgat

12、agaatgttaattttatttttctaagaggatttcagaatgtgtattgatatataaacttgttaaaagtatttataaatttgttacatctgaatataattttt

13、tgtttttaataggattcaacatctattgaaaaaatgtcaaattgttgtgaagaaatgtaagtattaa

14、gttatagtgatcttatttaaaaatagaaaccatactgtttgactacctttgagaatcatgtgcctatgttaatagtaggaaactaatatgttgatt

15、tttttttcttggtgtcctgtctgaggcccaagctagacaggcgtatcccagtcttactgtaggggtctttcagccatgc(即，seq id

16、no：2，其中下划线部分显示的是zdhhc21基因第8号外显子，其中的小写“t”为突变位点，为核苷酸a→t的突变)。

17、在具体实施方案中，cas9 mrna为基因工程领域的常规工具序列(例如，在mali p,yang l,esvelt km,aach j,guell m,et al.(2013)rna-guided human genomeengineering via cas9.science 339:823-826中报道的)，可以识别的pam序列是5'-ngg-3'。

18、第三方面，本发明提供了一种利用crispr-cas9技术向zdhhc21基因中引入目的突变的方法，所述方法使用如上述第一方面所述的特异性靶向zdhhc21基因的sgrna，或者如上述第二方面所述的crispr-cas9基因打靶系统。

19、第四方面，本发明提供了如上述第一方面所述的特异性靶向zdhhc21基因的sgrna，或者如上述第二方面所述的crispr-cas9基因打靶系统在制备zdhhc21基因突变的细胞或动物模型中的应用；

20、优选地，所述动物为小鼠，更优选为c57bl/6j小鼠。

21、第五方面，本发明提供了一种构建zdhhc21基因突变小鼠模型的方法，所述方法包括：

22、(1)构建同源重组载体，所述同源重组载体中包含含有zdhhc21突变位点的donordna序列；

23、(2)将步骤1)所构建的同源重组载体与cas9 mrna、如权利要求1所述的sgrna一起显微注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植入假孕受体母鼠进行孕育，获得f0代zdhhc21基因突变小鼠；

24、(3)将f0代zdhhc21基因突变小鼠与野生型小鼠杂交，获得f1代zdhhc21基因突变杂合子小鼠；以及

25、任选地，(4)使步骤(3)所得f1代zdhhc21基因突变杂合子小鼠自交，获得f2代zdhhc21基因突变纯合子小鼠。

26、对于上述构建方法：

27、在一种可行的实施方案中，所述zdhhc21基因突变为导致zdhhc21蛋白第209位氨基酸t→s的基因突变。

28、优选地，步骤(1)中，所述zdhhc21突变位点为zdhhc21基因第8号外显子中第4位核苷酸a→t的突变；进一步优选地，所述含有zdhhc21突变位点的donor dna序列如seq idno：2所示；

29、此外，优选地，所述同源重组载体还包含5’同源臂和3’同源臂；进一步优选地，所述5’同源臂具有如seq id no:5所示的序列，所述3’同源臂具有如seq id no:6所示的序列。

30、在一种可行的实施方案中，步骤(2)中，小鼠和母鼠的品系为c57bl/6j；

31、优选地，步骤(2)中还包括提取f0代小鼠的基因组dna进行pcr扩增、测序，以进行基因型鉴定的步骤；

32、进一步优选地，用于所述pcr扩增的引物组包括dna序列分别如seq id no:7和seqid no:8所示的引物，用于所述测序的引物组包括dna序列分别如seq id no:9、10、11所示的引物。

33、在一种可行的实施方案中，步骤(3)或步骤(4)中还分别包括提取f1代或f2代小鼠的基因组dna进行pcr扩增、测序，以进行基因型鉴定的步骤；

34、优选地，用于所述pcr扩增的引物组包括dna序列分别如seq id no:12和seq idno:13所示的引物，用于所述测序的引物组包括dna序列如seq id no:14所示的引物。

35、第六方面，本发明提供了根据上述第五方面所述的方法构建的zdhhc21基因突变小鼠模型作为阿尔茨海默病模型在研究阿尔茨海默病的发生、发展机制或筛选阿尔茨海默病的治疗药物中的应用。

36、有益效果

37、本发明提供的特异性靶向zdhhc21基因的sgrna可用于通过crispr-cas9技术向zdhhc21基因中引入特定的目的突变，从而可用于构建zdhhc21基因突变(例如zdhhc21t209s)的细胞或动物模型；根据本发明的构建zdhhc21基因突变的细胞或动物模型的方法具有较高的成功率，并且，通过该方法构建的zdhhc21 t209s突变的小鼠模型，经行为学、形态学、分子生物学检测证实，其在认知功能、脑组织病理及分子水平方面均表现出阿尔茨海默病的早期特征性表型，因此可以作为阿尔茨海默病的动物模型用于研究阿尔茨海默病的发生、发展机制(特别是研究zdhhc21基因在阿尔茨海默病的发生发展中所起的作用)或筛选阿尔茨海默病的治疗药物，具有重大的产业价值。