一种用于合成2`-氟-脱氧核糖核苷的固定化酶的制备方法及应用

一种用于合成2
’‑
氟-脱氧核糖核苷的固定化酶的制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及化合物合成技术领域，具体涉及一种固定化酶催化合成2
’‑
氟-脱氧核糖核苷的制备方法。


背景技术：

[0002]2’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷，英文名称：2
′‑
fluorine-deoxyribonse adenosine，是核苷类似物家族的一员。核苷类似物是抗肿瘤药物的重要中间体。
[0003]
核苷类似物是最大的一类抗病毒药物，也是最重要的抗病毒药物。治疗疱疹的阿昔洛韦，第一种治疗艾滋病的药物齐多夫定，治疗乙肝的恩替卡韦以及吉利德的明星丙肝药，史上最贵的药片索菲布韦都属于这一类药物。除了抗病毒，核苷类似物还可以用于治疗癌症。核苷类似物针对的是病毒的聚合酶，rna病毒复制所需的rna复制过程和逆转录病毒复制所需的逆转录过程在人体细胞中不会发生。因此病毒如果要复制，必须用自己的聚合酶，如rna 病毒的rna复制酶和逆转录病毒的逆转录酶，而核苷类似物通过选择性的抑制病毒的聚合酶来阻止病毒的复制。目前，核苷类似物家族的主要成员有嘧啶类似物阿糖胞苷(1-β-d-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶与吉西他滨(2,2-二氟-2
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脱氧胞苷)，嘌呤类似物氟达拉滨(9-β-d-阿拉伯糖基-2-氟腺嘌呤单磷酸与克拉屈滨(2-氯-2
’‑
脱氧腺苷)。大多数核苷类似物本身是不具有活性的，当它作为抗癌药物发挥作用时，先是通过特定的核苷转运蛋白进入细胞，然后通过脱氧核苷激酶，核苷单磷酸激酶和二磷酸激酶代谢为细胞内的活性二磷酸和三磷酸化衍生物，之后通过掺入核酸，以及抑制修饰内源性脱氧核糖核苷酸的细胞稳态的酶的活性(核糖核苷酸还原酶、dna和rna聚合酶、ctp合成酶)来获得细胞毒活性。
[0004]
绝大多数的核苷类似物已经可以通过化学方法来合成，尽管化学合成方法的开发取得了令人瞩目的进展，但是许多抗病毒和抗癌药物以及其他具有生物活性的化合物的生产仍然是一个挑战。这导致高昂的药物成本，因此阻碍了广泛的生物学研究以及治疗应用，显然这需要开发新策略。
[0005]
目前，最常见的合成2
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氟-脱氧腺苷技术路线如式，通过使用9-β-d-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤为起始原料，经过五步反应合成2
’‑
氟-脱氧腺苷，步骤繁琐，因此，能在环境友好的条件下有效合成核苷类似物的生物催化提供了更有吸引力的替代途径。
[0006]


技术实现要素：

[0007]
本发明要解决现有技术中存在的技术问题及系列缺点，提供一种合成2
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氟-脱氧核糖核苷的固定化酶的制备方法，通过固定化酶的形式进行转化反应，可提高酶的利用率，同时可有效防止副产物的生成，满足2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷的合成需求。
[0008]
本发明采用的技术方案如下：
[0009]
固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
s1选取编码尿苷磷酸化酶和碱基磷酸化酶基因，克隆至载体质粒上，转化入在大肠杆菌内进行表达，将重组大肠杆菌菌株接种至lb液体培养基中发酵培养；
[0011]
s2经诱导剂诱导蛋白表达发酵，得到含有尿苷磷酸化酶和碱基磷酸化酶的培养菌液；
[0012]
s3将培养菌液使用离心机离心，收集发酵菌体，用磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和碱基磷酸化酶的破碎液；
[0013]
s4向破碎液中加入高分子化合物载体，置于恒温摇床上，振荡；
[0014]
s5将振荡后的混合液过滤，收集载有酶的高分子化合物，即为固定化酶；
[0015]
s6向固定化酶中加入1倍体积的缓冲液，搅拌均匀，过滤除杂，重复上述步骤1～2次，收集固定化酶载体。
[0016]
其中步骤s1中的接种比例为按1∶100的体积比接种至lb液体培养基中。
[0017]
其中步骤s1和s2中的碱基磷酸化酶选自腺嘌呤磷酸化酶、胞嘧啶磷酸化酶或胸腺嘧啶磷酸化酶。
[0018]
其中步骤s2诱导剂选自异丙基硫代半乳糖苷和l-阿拉伯糖，浓度为0.5-2mmol/l。
[0019]
其中步骤s4中的高分子载体加入量为0.5g～1.5g。
[0020]
所述的制备方法制得的固定化酶或固定化酶载体用于制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷的用途。
[0021]
利用上述固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷的方法，包括如下步骤：
[0022]
(1)选取合适的供糖核苷和受体碱基作为原料，将脱氧核糖供体和碱基供体称量
后加入反应体系，加入磷酸盐缓冲液搅溶解，得2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷反应液；
[0023]
(2)向固定化酶载体中加入1倍体积的缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中；
[0024]
(3)在填充柱中加入(1)中所制备的2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷反应液，维持ph缓慢振荡反应，反应结束后，将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品，即制得2
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氟-2
’‑
脱氧核糖核苷。
[0025]
其中所述步骤(1)中的脱氧核糖供体和碱基供体的摩尔比为1:1～2。
[0026]
其中所述步骤(2)中的缓冲液为20mmol/l的磷酸盐缓冲液。
[0027]
其中所述步骤(3)中的反应时间为16-48h，反应过程中反应体系的ph维持为6.0-8.0。
[0028]
其中所述步骤(3)中的反应温度为40℃-80℃。
[0029]
上述生物催化反应的反应式为：
[0030][0031]
(r＝腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)
[0032]
本发明的有益效果：通过固定化酶的使用，简化了制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷的过程，改进了目前液酶使用的缺点，与当前液酶反应相比提高了酶的利用效率，减少了三废排放，提高产品质量、降低生产成本和劳动强度，且便于过程控制，具有重要的工业应用价值和社会价值。另一方面，固定化酶能够反复、多次使用，提高了酶的使用效率，减低了生产成本；固定化酶易与反应体系分离，避免了产物中残留蛋白杂质，简化了产物的提纯工艺，提高了产物的纯度；固定化酶的稳定性较游离酶有提高，使不同批次之间产物的稳定性提高。
附图说明
[0033]
图1为2
’‑
氟-脱氧核糖尿苷的高效液相色谱图
[0034]
图2为腺嘌呤的高效液相色谱图
[0035]
图3为本发明制备2
’‑
氟-脱氧核糖腺苷的生物合成方法过程中的高效液相色谱图
[0036]
图4为本发明制备2
’‑
氟-脱氧核糖腺苷的生物合成方法结束后的高效液相色谱图
具体实施方案
[0037]
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0038]
实施例1制备固定化酶
[0039]
①
先将尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的体积比接种至lb 液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的培养菌液；
[0040]
尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株是将编码嘌呤磷酸化酶(pnpase)和编码尿苷磷酸化酶(upase)的基因克隆至pet28a载体，转化入大肠杆菌bl21宿主内进行表达，所述的酶基因可从ncbi序列可由数据库获取；
[0041]
大肠杆菌培养基为lb液体培养基，含有：10g/l的蛋白胨，5g/l的酵母粉，10g/l的氯化钠；
[0042]
所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为0.5mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)；
[0043]
前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的菌体，用20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为800-1000bar。离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的破碎液， sds-page电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，所述嘌呤磷酸化酶分子量为27kda，尿苷磷酸化酶分子量为46kda；
[0044]
向细胞破碎液中加入1.5g高分子化合物载体(mi-150ida或mi-300ida)，置于4℃的恒温摇床上，振荡24h；将振荡后的混合液过滤除杂，得到固相，即为固定化酶；向固定化酶中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，滤除杂质，收集固定化酶载体。
[0045]
利用固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷
[0046]
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷10ml(浓度为10mm)，称取底物腺嘌呤，使其与底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷的摩尔比为1:1，加20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液搅拌均匀，制得反应液；
[0047]
②
向固定化酶载体中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中；
[0048]
③
向
②
填充柱中加入步骤
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，用naoh将ph调至7.0，调整反应温度至40℃，开始缓慢振荡反应16h，然后将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；用高效液相色谱仪(hplc)对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应16h底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷转化率达到最高为58.78％且不再变化。
[0049]
所述的hplc检测方法是：色谱柱ultimate xb-c18(4.6
×
250mm，5μm)，乙腈/teaa(5/95， v/v)为流动相，流速是1ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，检测时间为20min。
[0050]
实施例2
[0051]
(1)制备固定化酶：
[0052]
①
先将尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的体积比接种至lb 液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶培养菌液，
[0053]
本所述的尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株是将编码嘌呤磷酸化酶 (pnpase)和编码尿苷磷酸化酶(upase)的基因克隆至pbad载体，转化入大肠杆菌top10宿主内进行表达。
[0054]
大肠杆菌培养基为lb液体培养基，含有：10g/l的蛋白胨，5g/l的酵母粉，10g/l的氯化钠，
[0055]
所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为0.2％的l-阿拉伯糖，
[0056]
在前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的菌体，用20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为800-1000bar。离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的破碎液， sds-page电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，所述嘌呤磷酸化酶分子量为27kda，尿苷磷酸化酶分子量为46kda；
[0057]
②
向细胞破碎液中加入1.5g高分子化合物载体，置于4℃的恒温摇床上，振荡24h；将振荡后的混合液过滤除杂，得到固相，即为固定化酶；向固定化酶中加入1倍体积的 20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，滤除杂质，收集固定化酶载体。
[0058]
(2)利用固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷：
[0059]
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷10ml(浓度为10mm)，称取底物腺嘌呤，使其与底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷的摩尔比为1:1.5，加20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液搅拌均匀，制得反应液，用naoh将ph调至7.0，调整反应温度至50℃。
[0060]
②
向固定化酶载体中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中。
[0061]
③
向
②
中加入步骤
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，开始缓慢振荡反应24h，然后将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；用高效液相色谱仪(hplc)对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应24h底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷转化率达到最高为62.65％且不再变化。
[0062]
所述的hplc检测方法是：色谱柱ultimate xb-c18(4.6
×
250mm，5μm)，乙腈/teaa(5/95， v/v)为流动相，流速是1ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，检测时间为20min。
[0063]
实施例3
[0064]
(1)制备固定化酶：
[0065]
①
制备尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶液，先将尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的体积比接种至lb液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶培养菌液，
[0066]
所述的尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株是将编码嘌呤磷酸化酶(pnpase) 和编码尿苷磷酸化酶(upase)的基因克隆至pbad载体，转化入大肠杆菌top10宿主内进行表达，
[0067]
大肠杆菌培养基为lb液体培养基，含有：10g/l的蛋白胨，5g/l的酵母粉，10g/l的
氯化钠，
[0068]
所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为0.2％的l-阿拉伯糖，
[0069]
前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的菌体，用20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为800-1000bar。离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的破碎液， sds-page电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，所述嘌呤磷酸化酶分子量为27kda，尿苷磷酸化酶分子量为46kda。
[0070]
②
向细胞破碎液中加入0.5g高分子化合物载体，置于4℃的恒温摇床上，振荡24h；将振荡后的混合液过滤除杂，向固定化酶中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，滤除杂质，得到固相，即为固定化酶，收集固定化酶载体。
[0071]
(2)利用固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷：
[0072]
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷10ml(浓度为10mm)，称取底物腺嘌呤，使其与底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷的摩尔比为1:2，加20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液搅拌均匀，制得反应液，用naoh将ph调至7.0，调整反应温度至60℃。
[0073]
②
向固定化酶载体中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中。
[0074]
③
向
②
中加入步骤
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，开始缓慢振荡反应36h，然后将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；用高效液相色谱仪(hplc)对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应36h底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷转化率达到最高为49.87％且不再变化。
[0075]
所述的hplc检测方法是：色谱柱ultimate xb-c18(4.6
×
250mm，5μm)，乙腈/teaa(5/95， v/v)为流动相，流速是1ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，检测时间为20min。
[0076]
实施例4
[0077]
(1)制备固定化酶：
[0078]
①
制备尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶液，先将尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的体积比接种至lb液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶培养菌液，
[0079]
所述的尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株是将编码嘌呤磷酸化酶(pnpase) 和编码尿苷磷酸化酶(upase)的基因克隆至pbad载体，转化入大肠杆菌top10宿主内进行表达，
[0080]
大肠杆菌培养基为lb液体培养基，含有：10g/l的蛋白胨，5g/l的酵母粉，10g/l的氯化钠，
[0081]
所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为0.2％的l-阿拉伯糖，
[0082]
前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养的菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的菌体，用20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为800-1000bar。离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的破碎液， sds-page电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，所述嘌呤磷酸化酶分子量为
27kda，尿苷磷酸化酶分子量为46kda；
[0083]
②
向细胞破碎液中加入1.0g高分子化合物载体，置于4℃的恒温摇床上，振荡24h；将振荡后的混合液过滤除杂，得到固相，即为固定化酶，收集固定化酶载体。
[0084]
(2)利用固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷：
[0085]
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷10ml(浓度为10mm)，称取底物腺嘌呤，使其与底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷的摩尔比为1:1.5，加20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液搅拌均匀，制得反应液，用naoh将ph调至7.0，调整反应温度至70℃。
[0086]
②
向固定化酶载体中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中。
[0087]
③
向
②
中加入步骤
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，开始缓慢振荡反应48h，然后将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；用高效液相色谱仪(hplc)对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应48h底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷转化率达到最高为39.25％且不再变化。
[0088]
所述的hplc检测方法是：色谱柱ultimate xb-c18(4.6
×
250mm，5μm)，乙腈/teaa(5/95， v/v)为流动相，流速是1ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，检测时间为20min。
[0089]
实施例5
[0090]
(1)制备固定化酶：
[0091]
①
制备尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶液，先将尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的体积比接种至lb液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶培养菌液，
[0092]
所述的尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株是将编码嘌呤磷酸化酶(pnpase) 和编码尿苷磷酸化酶(upase)的基因克隆至pbad载体，转化入大肠杆菌top10宿主内进行表达，
[0093]
大肠杆菌培养基为lb液体培养基，含有：10g/l的蛋白胨，5g/l的酵母粉，10g/l的氯化钠，
[0094]
所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为0.2％的l-阿拉伯糖，
[0095]
前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养的菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的菌体，用20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为800-1000bar。离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的破碎液， sds-page电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，所述嘌呤磷酸化酶分子量为27kda，尿苷磷酸化酶分子量为46kda；
[0096]
②
向细胞破碎液中加入1.5g高分子化合物载体，置于4℃的恒温摇床上，振荡24h；将振荡后的混合液过滤除杂，得到固相，即为固定化酶，收集固定化酶载体。
[0097]
(2)利用固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷：
[0098]
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷10ml(浓度为10mm)，称取底物腺嘌呤，使其与底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷的摩尔比为1:2，加20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液搅拌均匀，制得反应液，用naoh将ph调至7.0，调整反应温度至80℃。
[0099]
②
向固定化酶载体中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后加入
填充柱中。
[0100]
③
向
②
中加入步骤
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，开始缓慢振荡反应48h，然后将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；用高效液相色谱仪(hplc)对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应48h底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷转化率达到最高为31.01％且不再变化。
[0101]
所述的hplc检测方法是：色谱柱ultimate xb-c18(4.6
×
250mm，5μm)，乙腈/teaa(5/95， v/v)为流动相，流速是1ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，检测时间为20min。
[0102]
实施例6
[0103]
(1)制备固定化酶：
[0104]
①
制备尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶液，先将尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株按1∶100的体积比接种至lb液体培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶培养菌液，
[0105]
所述的尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶重组大肠杆菌菌株是将编码嘌呤磷酸化酶(pnpase) 和编码尿苷磷酸化酶(upase)的基因克隆至pbad载体，转化入大肠杆菌top10宿主内进行表达。
[0106]
大肠杆菌培养基为lb液体培养基，含有：10g/l的蛋白胨，5g/l的酵母粉，10g/l的氯化钠，
[0107]
所述的诱导蛋白表达使用的诱导剂为0.2％的l-阿拉伯糖，
[0108]
前述诱导蛋白质表达发酵结束后，将培养菌液使用离心机8000rpm离心10min，收集发酵菌体，该发酵菌体即为含有尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的菌体，用20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液将收集的菌体重悬，将重悬菌体放置在冰水浴中，用经高压细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为800-1000bar。离心收集上清液即为含尿苷磷酸化酶和嘌呤磷酸化酶的破碎液， sds-page电泳检测蛋白表达正常，且都位于上清液中，所述嘌呤磷酸化酶分子量为27kda，尿苷磷酸化酶分子量为46kda。
[0109]
②
向细胞破碎液中加入1.5g高分子化合物载体，置于4℃的恒温摇床上，振荡24h；将振荡后的混合液过滤除杂，得到固相，即为固定化酶，收集固定化酶载体。
[0110]
(2)利用固定化酶制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧核糖核苷：
[0111]
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷10ml(浓度为10mm)，称取底物腺嘌呤，使其与底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷的摩尔比为1:2，加20mm ph 7.0磷酸盐缓冲液搅拌均匀，制得反应液，用naoh将ph调至7.0，调整反应温度至50℃。
[0112]
②
向固定化酶载体中加入1倍体积的20mmol/l的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后加入填充柱中。
[0113]
①
向
②
中加入步骤
①
制备2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷反应液，开始缓慢振荡反应24h，然后将缓冲液加入到填充柱中，进行洗脱，收集液体样品；用高效液相色谱仪(hplc)对反应液不同反应时间的底物转化率进行检测，结果显示反应24h底物2
’‑
氟-2
’‑
脱氧尿苷转化率达到最高为46.30％且不再变化。
[0114]
所述的hplc检测方法是：色谱柱ultimate xb-c18(4.6
×
250mm，5μm)，乙腈/teaa(5/95， v/v)为流动相，流速是1ml/min，柱温40℃，检测波长254nm，检测时间为20min。
[0115]
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用以限定本发明的保护
范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。