纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌及它们的应用

本发明涉及生物转化领域，尤其涉及一种纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌构建以及多酶协同降解杨木纤维产糖的应用。

背景技术：

1、木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源之一，具有环保、非食物竞争性、成本低廉、可持续性等优点，在开发清洁能源和生物基化学品方面具有巨大的潜力。然而，大量的木质纤维素资源以燃烧告终，造成资源的浪费，且产生环境污染。为了提高木质纤维素的使用价值，实现它的生物质高效转化是关键，但是由于木质纤维素的组成复杂，由纤维素、半纤维素和木质素这三种聚合物聚集而成以及它们之间存在丰富的分子间链接，导致木质纤维素的生物转化效率低下。同时，纤维素酶在木质纤维素的生物转化中占有重要的地位，但由于碳代谢抑制，天然纤维素酶的活性普遍较低。如何提高纤维素酶活性，实现木质纤维素的高效转化，是当今学者们的研究热点。目前，我国在高产菌株的选育上已经有了很大的进步，但由于所培育的菌种酶活性低、菌种易退化等问题，制约了其工业中的应用。基于这些结果，利用基因克隆和异源表达技术，对产纤维素酶菌株进行改造，得到性能更好的重组菌，为构建高效率的纤维素降解菌提供了新的思路。

2、杨树作为速生木材，是我国一种重要的人工林树种。我国在人工林和速生林方面有着悠久的历史，目前已拥有4666万公顷的人工林，在全球排名第一。然而，由于速生杨木自身的缺陷，如抗压能力不足、易弯曲变形等，使得其主要应用于包装、一次性筷子等领域。总的来说，杨树产业利用率低，能源消耗高，排污严重，产品附加值低，制约了其利用。然而，通过生物、物理或化学手段，将杨木木质纤维素转化还原糖，再以还原糖为原料生产高附加值产品，可提高杨木生物质的利用率，实现生物质利用的绿色化。

3、提高纤维素的催化水解效率是促进纤维素降解和转化的一个重要环节。纤维二糖脱氢酶等纤维素降解辅助蛋白有望成为提高纤维素酶解效率的辅助因子。但是，目前对这种酶的研究还停留在实验室的基础研究阶段，因此，如何将其高效、低廉地用于纤维素生物转化的工业化生产仍是一个很大的挑战。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的首要目的是提供纤维二糖脱氢酶基因，该基因表达的纤维二糖脱氢酶能够提高纤维酶解产糖率，具有很好的应用前景。

2、纤维二糖脱氢酶基因，序列如seq no.1所示。

3、本发明的第二个目的是提供表达所述的纤维二糖脱氢酶基因的载体。

4、所述的载体，空白载体包括pucm-t或pbargpe1-hygro。

5、所述的载体，gcdh(纤维二糖脱氢酶基因片段)与载体dna摩尔比3:1。

6、本发明的第三个目的是提供纤维二糖脱氢酶重组菌，将表达所述的纤维二糖脱氢酶基因的载体导入黑曲霉中获得。

7、进一步地，通过原生质体法，在peg-4000的介导下，将表达所述的纤维二糖脱氢酶基因的载体导入黑曲霉中获得。

8、本发明的第四个目的是提供所述的纤维二糖脱氢酶、所述的载体表达的纤维二糖脱氢酶，或者所述的纤维二糖脱氢酶重组菌产生的纤维二糖脱氢酶在降解木质纤维素中的应用。

9、进一步地，与漆酶和纤维二糖酶协同降解木质纤维素。更进一步地，降解木质纤维素的产糖条件：

10、木质纤维素预处理是将木屑与4％naoh按料液比1：10，1.1mpa、121℃，处理90min，冷却后过滤除去预处理液，木渣用蒸馏水清洗至洗涤液呈中性；处理好的木屑烘干称重，粉碎至100目。

11、降解木质纤维素的产糖条件：

12、反应体系为2.4mg/ml-2.6mg/ml naf溶液，反应温度48-50℃、反应ph4.7-4.9、反应时间46h-50h、纤维素酶1-3mg/ml；漆酶添加量35-40u/g预处理的木质纤维素、纤维二糖脱氢酶添加量54-58u/g预处理的木质纤维素、纤维二糖酶添加量80 -90u/g预处理的木质纤维素。

13、优选，反应体系为2.5mg/ml naf溶液、反应温度50℃、反应ph4.8、反应时间48h、纤维素酶2mg/ml；漆酶添加量38.558u/g预处理的木质纤维素、纤维二糖酶添加量89.679u/g预处理的木质纤维素、纤维二糖脱氢酶添加量55.485u/g预处理的木质纤维素。

14、进一步地，所述的木质纤维素来源于杨木。

15、本发明整体研究过程依次包括以下步骤：

16、(1)提取灰树花(grifola frondose)dna：灰树花菌块接种于pda液体培养基中，28℃，静置培养14d，过滤收集菌丝体，除干水分，用基因组dna提取试剂盒提取总dna。

17、(2)灰树花纤维二糖脱氢酶基因扩增：以总dna为模板，pcr扩增反应体系为20μl(2.5mm dntp 2μl、2μm gr 1μl、2μm gf 1μl、5u/μl lataq0.2μl、＜1μg/μl dna1μl、10×pcr bufferⅱ(含mg2+)2μl，ddh2o补足至20μl)，反应结束后，取5μl pcr反应产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测；其中引物序列见表1。

18、表1纤维二糖脱氢酶(cdh)扩增引物序列

19、

20、上述引物序列见seq no.2-3所示。

21、(3)基因回收：通过琼脂糖凝胶电泳分离，120v，30min，切下目的条带，装入离心管中，通过普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的条带gcdh。

22、(4)克隆载体的构建：使用已经线性化的载体pucm-t，利用t4dna连接酶将目的基因于克隆载体连接，连接体系见表2；

23、表2dna酶连接体系

24、

25、该体系在pcr仪中16℃过夜连接。

26、(5)克隆载体转化大肠杆菌感受态细胞：从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，插入冰盒，待其融化，加入上述全部连接产物，混匀后，冰浴30min。将上述感受态细胞于42℃中热激45s，然后再冰浴2min。向感受态细胞中加入700μl不含氨苄青霉素的lb液体培养基，混合均匀，37℃，190rpm培养1h。将13μl iptg和40μl x-gal涂布于含有氨苄青霉素的lb平板中，室温放置半小时待液体全部吸收，取50μl培养好的大肠杆菌菌液涂布于该平板中，37℃，过夜培养。

27、(6)菌落pcr检验：利用含iptg、x-gal、amp的lb平板来筛选转化子，过夜培养后lb平板上长出的淡黄色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌，而蓝色菌落为不含重组质粒的大肠杆菌，以此初步筛选阳性转化子。挑取淡黄色菌落，至含有20μlddh2o的离心管中，沸水浴10min，冷却至室温，12000rpm/min，离心1min，上清液作为pcr模板，按pcr扩增体系20μl(菌落上清液1μl，gf(2μm)1μl，gr(2μm)1μl，2×easytaq pcr supermix 10μl，ddh2o补足至20μl)进行菌落pcr反应。

28、(7)双酶切检验

29、挑取菌落pcr阳性菌落，接种至含amp的lb液体培养基，培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒，按表3进行双酶切检测，37℃，过夜酶切，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

30、表3pucm-t-gcdh双酶切反应体系

31、

32、(8)表达载体线性化：将pbargpe1-hygro(购自湖南丰晖生物科技有限公司)转化至大肠杆菌中，方法见(5)，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃，190rpm，过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取表达载体质粒，按照pbargpe1-hygro单酶切反应体系进行载体pbargpe1-hygro线性化，37℃，过夜酶切。酶切产物利用1％琼脂糖凝胶电泳回收。

33、(9)表达载体pbargpe1-hygro-gcdh的构建与转化：配制gcdh扩增体系，pcr产物利用1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，方法见(3)。利用easygeno单片段重组克隆试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，配制同源重组体系，构建pbargpe1-hygro-gcdh。将反应液混合后置于50℃反应15min。反应结束后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，37℃，过夜培养，挑选阳性转化子。

34、(10)表达载体阳性克隆转化子的筛选:菌落pcr检验方法见(6)和表达载体双酶切验证方法参考(7)。

35、(11)表达载体的回收：挑取阳性转化子，接种至含amp的lb液体培养基，培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒，质粒溶液-20℃保存。

36、(12)通过原生质体法，在peg-4000的介导下将pbargpe1-hygro-gcdh导入黑曲霉并使纤维二糖脱氢酶基因在黑曲霉中表达。

37、(13)杨木纤维最佳产糖条件：2.5mg/ml naf、纤维素酶2mg/ml、反应温度50℃、反应ph4.8、最佳酶添加量组合：漆酶添加量38.558u/g、纤维二糖酶添加量89.679u/g、纤维二糖脱氢酶添加量55.485u/g，与纤维素酶酶解产糖浓度相比提高了76.65％。

38、本发明通过基因工程的手段克隆出灰树花的纤维二糖脱氢酶基因，构建表达载体，并将其导入黑曲霉中表达，筛选出具有高效降解杨木纤维能力的重组黑曲霉；同时优化杨木纤维产糖酶组合，通过在纤维素降解体系中添加纤维二糖脱氢酶、漆酶、纤维二糖酶，提高杨木纤维及木质纤维素的产糖效率。

39、本发明灰树花纤维二糖脱氢酶基因序列如下：

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106、本发明的黑曲霉aspergillus niger c112，2012年4月23日保藏于《中国典型培养物保藏中心》，其保藏号为cctcc no:m 2012129，地址是中国武汉大学。