一株副干酪乳杆菌及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株副干酪乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.伤口愈合是人体最复杂的过程之一，益生菌广泛存在于皮肤中，在治疗细菌感染、缓和病原体引起的微生物失调和炎症、调节免疫系统和促进组织修复等方面都是有效的，并作为益生菌疗法在生物医学领域受到越来越多的关注。研究发现，鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、枯草芽孢杆菌等可以通过释放有机酸、细菌素、酶等抗菌剂来有效地防止病原菌的黏附和生物膜的形成；此外，它们还可以通过减少促炎因子的产生来调节炎症反应。可见，益生菌疗法在伤口治疗中的应用前景十分广泛。
3.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品。副干酪乳杆菌能促进机体微生物菌群和酶的平衡以及刺激特异性和非特异性的免疫机制，同时其分泌的副干酪乳杆菌素是一种抗菌小分子热稳定肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有明显的抑制作用。
4.皮肤上除了常见的病原菌，还存在益生菌。益生菌在维持宿主机体稳态，激活免疫系统、维持机体免疫平衡等方面具有重要作用。副干酪乳杆菌具有干酪乳杆菌属调节肠道和增强免疫力等益生功能，代谢产生的细菌素具有优良的抑菌性能。因此，在食品、医疗保健等领域发挥重要作用。现有技术中，副干酪乳杆菌在皮肤疾病中的应用局限于抑制皮肤致病菌的生长，改善痤疮、皮藓等皮肤炎症反应，鲜有报道副干酪乳杆菌在皮肤伤口愈合中的应用。此外，现有技术中采用的多为副干酪乳杆菌发酵的无菌上清液，采用发酵无菌上清液增加具体使用的难度和成本，因此，目前亟需一种成本低、效果较好，实际更容易制备的方法。


技术实现要素：

5.本发明针对上述技术问题，提供一株从陕西西安自然发酵太阳菌菌种中筛选到的副干酪乳杆菌菌株lacticaseibacillus paracasei tym202，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌的生长有一定抑制作用，且对皮肤伤口愈合有良好的促进作用。
6.为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
7.一株副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌菌株lacticaseibacillus paracasei tym202，于2022年7月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院9号楼5楼，保藏号为gdmcc no:62627，所述副干酪乳杆菌16srdna基因序列如seq id no.1所示。
8.如上所述副干酪乳杆菌在制备抑制常见皮肤病原菌的药物中的应用，所述的皮肤病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或沙门氏菌。
9.如上所述副干酪乳杆菌在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
10.如上所述副干酪乳杆菌发酵后的菌液在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
11.作为优选，所述发酵后的菌液为将活化的副干酪乳杆菌tym202菌液以5％(v/v)的接种量接种至mrs液体培养基，于37℃培养箱培养16h，离心，用无菌生理盐水调整菌液浓度为1
×
107cfu/ml，即得tym202发酵后的菌液。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13.本发明将筛选所得的lacticaseibacillus paracase tym202能有效的抑制致病菌大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)和沙门氏菌(salmonella)的生长，lacticaseibacillus paracase tym202直接原位敷于伤口表面，其生长过程中产生的代谢物如乳酸、细菌素等可促进皮肤伤口愈合，此外，该菌还可能通过调节伤口微环境的菌群结构来促进伤口愈合；进一步的本发明副干酪乳杆菌lacticaseibacillus paracase tym202的发酵培养基为mrs，该培养基成分便宜易得，因此lacticaseibacillus paracase tym202生产成本低，可大规模应用于皮肤伤口愈合。
14.保藏信息
15.副干酪乳杆菌菌株lacticaseibacillus paracasei tym202于2022年7月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no:62627。
附图说明
16.图1是本发明副干酪乳杆菌形态学特征；其中图1左图为lacticaseibacillus paracasei tym202在mrs固体培养基上的菌落形态，图1右图为革兰氏染色。
17.图2是本发明副干酪乳杆菌tym202的发酵菌液(s22)和发酵无菌上清液(sw22)对三种常见致病菌的抑菌圈。
18.图3(a)是不同处理在不同时间大鼠伤口情况图，图3(b)为不同处理在不同时间的愈合率。
19.图4为处理11天后各组伤口he染色图；其中，a为对照组；b为j22组；c为sw22组；d为s22组。
具体实施方式
20.下面结合各附图以及具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
21.实施例中使用的各培养基组成：
22.1l mrs固体培养基的组成是：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉10g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，葡萄糖10g，琼脂15g。
23.1l mrs液体培养基的组成是：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉10g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，葡萄糖10g。
24.1l bih液体培养基的组成是：蛋白胨10g，脱水小牛脑浸粉12.5mg，脱水牛新浸粉5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g。
25.lb培养基市售所得。
26.实施例1
27.菌株的分离与鉴定
28.(1)样品采集：样品为陕西西安自然发酵太阳菌菌种，以无菌密封袋密封置于-20
℃冰箱保存；
29.(2)稀释涂布：采用无菌磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释成1
×
10-6
、1
×
10-7
、1
×
10-8
、1
×
10-9
梯度浓度，将稀释液分别涂布于mrs固体培养基上，于37℃下培养48h；
30.(3)分离单菌落：分别挑取步骤(2)固体培养基上形态不同的菌落在mrs固体培养基上进行划线，于37℃下培养48h，此过程重复三次以上直至培养出纯菌落；
31.(4)菌落形态观察与革兰氏染色：挑取纯菌落于mrs液体培养基中，在37℃下培养15h；在mrs固体培养基上划线培养步骤(3)得到的纯菌株tym202(37℃，15h)，观察到菌落为乳白色，呈圆形凸起，边缘整齐，轻微不规则弯曲杆状，如图1所示；
32.挑取tym202进行革兰氏染色，步骤如下：涂片固定，用结晶紫染1分钟，自来水冲洗，吸去水分；加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗，用吸水纸吸去水分；加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；番红染色液染1分钟后，自来水冲洗，干燥，在显微镜上进行镜检；在100倍物镜下观察到菌体为杆状，呈紫色(如图1所示)，判定为革兰氏阳性菌；
33.(6)生理生化试验鉴定：参考《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株tym202的部分生理生化实验进行研究，结果见表1、表2。
34.表1tym202生理生化特性
[0035] 葡萄糖产气葡萄糖产酸过氧化氢酶甲基红吲哚tym202-+
‑‑
+
[0036]
注：+阳性反应；-阴性反应
[0037]
表2tym202糖醇发酵实验结果
[0038] 葡萄糖蔗糖乳糖淀粉麦芽糖果糖山梨醇海藻糖tym202++++++++
[0039]
注：+阳性反应；-阴性反应
[0040]
(6)菌株鉴定：挑取步骤(4)得到的纯菌株tym202进行16srdna检测，检测结果用ncbi中的blast程序与数据库中的细菌16s rdna序列进行了相似性比对，比对结果如seq id no.1，tym202菌株为lacticaseibacillus paracase；命名为lacticaseibacillus paracase tym202，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no：62627。
[0041]
实施例2
[0042]
lacticaseibacillus paracase tym202发酵液的制备及其抑菌活性
[0043]
(1)副干酪乳杆菌tym202发酵无菌上清液(sw22)制备：将活化的副干酪乳杆菌tym202菌液以5％(v/v)的接种量移至mrs液体培养基，于37℃培养箱培养16h，离心取上清液，过0.22μm滤膜得tym202无菌上清液样品；
[0044]
(2)副干酪乳杆菌tym202发酵菌液(s22)制备：将活化的副干酪乳杆菌tym202菌液以5％(v/v)的接种量移至mrs液体培养基，于37℃培养箱培养16h，得tym202发酵液；
[0045]
(3)菌种活化：将冻存的大肠杆菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)用lb培养基活化，沙门氏菌(salmonella)用bhi液体培养基活化；
[0046]
(4)抑菌实验：用无菌生理盐水将e.coli、s.aureus、salmonella菌液稀释至od600值为0.5左右，取100ul涂布于相应的固体培养基，随后在培养基上打孔，每孔加入50ul步骤(1)、(2)两种样品(tym202无菌上清液样品、tym202发酵液)，37℃过夜培养；图2为s22和
sw22抑菌圈照片，表3为相应的抑菌圈直径。
[0047]
表3s22和sw22的抑菌圈直径(mm)
[0048] e.colis.aureussalmonellasw2214.00
±
0.6011.18
±
0.3410.31
±
1.58s2214.06
±
0.5211.97
±
0.6911.86
±
0.20
[0049]
结果显示，s22和sw22对三种致病菌的生长均起到一定的抑制作用，抑菌圈明显，且两种样品的抑菌活性相差不大。此外，两种样品对革兰氏阴性大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果强于对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑菌效果；而且对同为革兰氏阴性的致病菌，两种样品对大肠杆菌的抑制效果强于沙门氏菌。
[0050]
实施例3
[0051]
lacticaseibacillus paracase tym202在皮肤伤口愈合中的应用
[0052]
(1)副干酪乳杆菌tym202菌液(j22)制备：将活化的副干酪乳杆菌tym202菌液以5％(v/v)的接种量移至mrs液体培养基，于37℃培养箱培养16h，10000
×
g离心20min，所得菌泥沉淀用无菌生理盐水重新悬浮，10000
×
g离心20min，重复此操作三次以清洗菌体，最后用无菌生理盐水调整菌液浓度为1
×
107cfu/ml，得tym202菌液(不含培养基，含活菌以及发酵后所得物质)；
[0053]
(2)副干酪乳杆菌tym202发酵无菌上清液(sw22)制备：将活化的副干酪乳杆菌tym202菌液以5％(v/v)的接种量移至mrs液体培养基，于37℃培养箱培养16h，10000
×
g离心20min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，得tym202发酵无菌上清液(不含培养基和活菌，只有发酵后所得物质)；
[0054]
(3)副干酪乳杆菌tym202发酵菌液(s22)制备：将活化的副干酪乳杆菌tym202菌液以5％(v/v)的接种量移至mrs液体培养基，于37℃培养箱培养16h，得tym202发酵菌液(含培养基、活菌以及发酵后所得物质)；
[0055]
(4)大鼠伤口愈合实验：将8周龄雄性sd大鼠随机分为4组，每组4只，剔除大鼠背部毛发，在背部切出一个直径约10mm的全层皮肤伤口模型。按表4的分组情况分别在大鼠伤口处分别滴加上述三种样品溶液(步骤(1)tym202菌液、步骤(2)tym202发酵无菌上清液、步骤(3)tym202发酵菌液)0.5ml，以无菌生理盐水为对照组(control)，缠绕纱布，每天更换样品溶液，并拍照记录伤口愈合情况。
[0056]
图3为不同时间大鼠伤口照片，在第11天时，对照、j22、sw22、s22四组大鼠皮肤基本愈合，愈合率分别为：84.47％，97.85％，82.82％，93.86％。值得注意的是j22，s22组伤口在第7天、第9天的愈合情况明显优于对照组；在第9天时，j22，s22组大鼠的伤口愈合率分别为：94.68％，85.01％，而对照组只有78.07％，表明tym202可以加速皮肤伤口的愈合；
[0057]
(5)大鼠伤口he染色：处理11天后处死大鼠，取伤口处全层皮肤固定、包埋、he染色；图4为不同处理组的伤口he染色图，除对照组外，其余各组可见新生表皮及毛囊(实线箭头)，其中j22组数量最多，s22组次之，sw22组数量最少；此外，对照组新生毛细血管较少，局部水平方向角化不全(虚线箭头)且伴有炎细胞浸润(星号)；j22组成纤维细胞排列有序，逐渐向瘢痕组织转变；sw22及s22组真皮层及皮下组织层成纤维细胞数量较对照更多并存在少量炎细胞；综上所述，j22、s22组愈合效果均优于对照组，且j22组的愈合效果最好；sw22组与对照组愈合情况相似。
[0058]
表4大鼠皮肤伤口不同处理分组
[0059]
组别处理方式control无菌生理盐水处理j22副干酪乳杆菌tym202菌液处理sw22副干酪乳杆菌tym202发酵无菌上清液处理s22副干酪乳杆菌tym202发酵菌液处理
[0060]
本发明提供了一株从陕西西安自然发酵太阳菌菌种中筛选得到的副干酪乳杆菌，该菌对皮肤伤口愈合有较好的促进作用，经该菌处理过的伤口愈合速度明显优于对照组。
[0061]
本发明用lacticaseibacillus paracase tym202菌液、lacticaseibacillus paracase tym202发酵无菌上清液以及lacticaseibacillus paracase tym202含菌发酵液分别处理大鼠皮肤伤口，均显示出较好的愈合效果，11天时伤口愈合率分别为97.848％，82.82％，93.86％，而对照组为84.47％。其中lacticaseibacillus paracase tym202在伤口原位作用时，伤口愈合效果最佳，he染色结果显示该组新生表皮及毛囊数量较多，真皮层炎细胞少，即lacticaseibacillus paracase tym202促进了大鼠皮肤的伤口愈合。
[0062]
此外，lacticaseibacillus paracase tym202能抑制致病菌e.coli、s.aureus和salmonella的生长。经tym202发酵无菌上清液和tym202发酵菌液处理过的平板对三种致病菌的生长有明显的抑制作用，显示lacticaseibacillus paracase tym202有良好的抑菌效果。
[0063]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。