一种lncRNA编码的抗癌肽AC115619-22AA及应用的制作方法

一种lncrna编码的抗癌肽ac115619-22aa及应用
技术领域
1.本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种lncrna编码的抗癌肽ac115619-22aa及应用。


背景技术：

2.肝癌中晚期患者的总体效果较差，死亡率高达80％，中位生存期不足1年，5年生存率不足20％。常规肝癌治疗药物多为化疗药物和小分子靶向药物，这些药物毒副作用大，且容易产生耐药。而免疫检查点抑制剂等药物虽然效果明确，但受限于患者的免疫微环境，响应率不超过30％。因此开发新型的治疗肝癌的药物很有必要。
3.长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)是一种200个以上碱基构成的无蛋白编码rna。传统理论认为lncrna不具备编码能力，但近年来，越来越多的证据证实lncrna并非完全无氨基酸编码能力，虽然不能编码大分子的蛋白，但很多lncrna可以通过小的开放阅读框架(small open read frame，sorf)编码不到100个氨基酸的微小多肽段，这些lncrna编码的多肽在肿瘤的生物学过程中也扮演重要的作用。如一些lncrna编码的多肽可能抑制肿瘤的发生发展。这类多肽可作为抗癌肽药物，通过补充这类多肽，起到抑制肿瘤的作用。因此鉴定并利用这些lncrna编码的抗癌多肽对肿瘤的防治具有重大临床意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何得到这些能够编码抑制肿瘤生长的多肽的lncrna。
5.为了解决上述问题，本发明提供了一种由lncrna-ac115619编码的多肽ac115619-22aa，并提供其在制备治疗肝癌药物中的应用。
6.本发明首先提供了一种多肽。
7.本发明提供的多肽为氨基酸序列是序列表中seq id no.2的多肽。
8.本发明还提供了上述多肽的药用盐。
9.本发明的多肽的药用盐，包括醋酸盐(acetate)、乳糖醛酸盐(lactobionate)、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、月桂酸酯(laurate)、安息香酸盐(benzoate)、苹果酸盐(malate)、重碳酸盐(bicarbonate)、马来酸盐(maleate)、硫酸氢盐(bisulfate)、扁桃酸盐(mandelate)、酒石酸氢盐(bitartrate)，甲磺酸盐(mesylate)，硼酸盐(borate)，溴甲烷(methylbromide)，溴化物(bromide)，硝酸甲酯(methylnitrate)，依地酸钙(calcium edetate)，甲基硫酸盐(methylsulfate),右旋樟脑磺酸(camsylate)，粘酸盐(mucate)，碳酸盐(carbonate)，萘磺酸盐(napsylate)，氯化物(chloride)，硝酸盐(nitrate)，棒酸盐(clavulanate)，n-甲葡糖胺(n-methylglucamine)，柠檬酸盐(citrate)，铵盐(ammonium salt)，二氢氯化物(dihydrochloride)，油酸盐(oleate)，乙二胺四乙酸盐(edetate)，草酸盐(oxalate)，乙二磺酸盐(edisylate)，扑酸盐(pamoate)(双羟萘酸盐embonate)，丙酸酯月桂硫酸酯(estolate)，棕榈酸盐(palmitate)，乙磺酸酯(esylate)，泛酸盐
(pantothenate)，延胡索酸盐(fumarate)，磷酸盐/二磷酸(phosphate/diphosphate),葡庚糖酸盐(gluceptate)，聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate)，葡(萄)糖酸盐(gluconate)，水杨酸盐(salicylate)，谷氨酸盐(glutamate)，硬脂酸盐(stearate)，对羟乙酰氨基苯胂酸(glycollylarsanilate)，硫酸盐(sulfate)，羟基苯甲酸盐(hexylresorcinate)，碱式乙酸盐(subacetate)，海巴(hydrabamine)，琥珀酸盐(succinate)，氢溴酸盐(hydrobromide)，丹宁酸盐(tannate)，氢氯化物(hydrochloride)，酒石酸盐(tartrate)，羟萘酸盐(hydroxynaphthoate)，8-氯茶碱盐(teoclate)，碘化物(iodide)，甲苯磺酸盐(tosylate)，三乙基碘(triethiodide)，乳酸(lactate),戊酸盐(valerate)等。取决于用途，药用盐可以由阳离子如钠(sodium)、钾(potassium)、铝(aluminum)、钙(calcium)、锂(lithium)、锰(magnesium)和锌(zinc)、铋(bismuth)等所形成，也可由碱如氨、乙二胺(ethylenediamine)、n-甲基-谷氨酰胺(n-methyl-glutamine)、赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、鸟氨酸(ornithine)、胆碱(choline)、n,n'-二苄基乙二胺(n,n'-dibenzylethylene-diamine),氯普鲁卡因(chloroprocaine)，二乙醇氨(diethanolamine)，普鲁卡因(procaine),二乙胺(diethylamine)，哌嗪(piperazine)，三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)和羟化四甲铵(tetramethylammonium hydroxide)等所形成。这些盐可以采用标准方法制备，例如通过游离酸与有机或无机碱的反应。在一个碱性基团如氨基存在的情况下，酸性盐如氢氯化物(hydrochloride)、氢溴化物(hydrobromide)、醋酸盐(acetate)、扑酸盐(pamoate)等等可用作剂型；在一个酸性基团(如-cooh)或醇基存在的情况下，可药用的酯如醋酸酯(acetate)、马来酸酯(maleate)、三甲基乙酸氯甲酯(pivaloyloxymethyl)等、以及文献中公知的用于改善可溶性和水解性的酯可以用作持续释放和前体药制剂。
10.本发明还提供了具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物，所述药物含有前文所述的多肽或所述的药用盐。
11.在实际应用中，可以将本发明的多肽或其药用盐作为药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中，栓剂可为阴道栓剂，也可以是阴道环，也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制
成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
12.使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等；腔道给药，如经直肠、阴道和舌下；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。
13.上述药物中，所述肿瘤为肝癌。
14.上述药物中，所述药物具有如下至少一种性能：
15.a1、制备抑制肿瘤细胞活性的产品中的应用；
16.a2、制备抗肿瘤活性的产品中的应用。
17.本发明还提供了上述多肽在制备具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的产品中的应用。
18.上述的药用盐在制备具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的产品中应用也属于本发明要求保护的范围。
19.上述应用中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
20.本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为下述任一种：
21.c1)编码权利要求1所述多肽的核酸分子；
22.c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
23.c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体。
24.本发明提供一种由lncrna-ac115619编码的多肽ac115619-22aa，并研究了其在制备治疗肝癌药物中的应用。该多肽溶于超纯水后作用于肝癌细胞能够有效抑制肿瘤干细胞特性，抑制肝癌细胞增殖、迁移，并诱导肝癌细胞调亡。因此多肽ac115619-22aa是一种具有肝癌抑制作用的抗癌肽，可为作为治疗肝癌药物的候选组份或物质基础。
附图说明
25.图1为高效液相色谱法对人工合成的ac115619-22aa抗癌肽进行鉴定。
26.图2为液相色谱-质谱法对人工合成的ac115619-22aa抗癌肽进行鉴定。
27.图3为免疫荧光检测ac115619-22aa多肽被肝癌细胞吸收情况。
28.图4为ac115619-22aa抗癌肽有效抑制肝癌细胞的成球能力。
29.图5为不同浓度的ac115619-22aa抗癌肽对肝癌细胞的抑制作用。
30.图6为不同处理时间条件下400μg/ml的ac115619-22aa抗癌肽对肝癌细胞的抑制作用。
31.图7为ac115619-22aa抗癌肽有效抑制肝癌细胞的克隆形成能力。
32.图8为不同浓度ac115619-22aa抗癌肽在12h时诱导肝癌细胞调亡情况。
具体实施方式
33.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
34.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
36.实施例1、ac115619-22aa抗癌肽的人工合成
37.lncrna-ac115619(enst00000567376.2)是位于人类2号染色体的lncrna，具体染色体坐标为chromosome 2:20,999,313-21,000,917，长度1605个碱基。该lncrna为肝脏特异性lncrna，仅在肝脏中表达，且lncrna在肝癌细胞中呈现低表达。
38.通过核糖体测序及利用美国国家生物技术信息中心开发的orffinder数据库分析，鉴定到在此lncrna 471～536碱基处有一个长度为66个碱基的sorf区域，该sorf区域被首次证实可以编码多肽。此sorf的核苷酸序列为atggcaatacggaccccagatgtctccctggagctctgccaggatccattcaaggccaagaaagta(序列表中序列1)，翻译后的多肽含22个氨基酸，其氨基酸序列为：met-ala-ile-arg-thr-pro-asp-val-ser-leu-glu-leu-cys-gln-asp-pro-phe-lys-al a-lys-lys-val(甲硫氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-谷氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-缬氨酸)，氨基酸序列为序列表中序列2，分子量为：2488.7kda，将此肽称为ac115619-22aa多肽或ac115619-22aa。
39.根据已知的ac115619-22aa氨基酸序列，使用固相化学合成法人工合成该肽。随后采用高效液相色谱法(结果见图1)及液相色谱-质谱法(结果见图2)鉴定合成的ac115619-22aa。
40.结果显示ac115619-22aa的产物纯度》95％，水溶性良好。提示ac115619-22aa多肽合成无误。
41.实施例2、异硫氰酸荧光素fitc与ac115619-22aa多肽结合被细胞的摄取情况
42.在进行多肽合成时，将异硫氰酸荧光素fitc标记到ac115619-22aa。将huh7肝癌细胞(购于武汉普诺赛生命科技有限公司公司，货号：cl-0120)以2万个/每孔的密度种植于6孔板继续常规培养24h。随后将fitc标记的ac115619-22aa多肽以400μg/ml的浓度加入dmem培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司公司，货号：pm150210b)，继续培养4h。结果如图3所示，免疫荧光检测发现ac115619-22aa可被肝癌细胞吸收至细胞质中，提示该肽被细胞吸收良好，能够穿透细胞膜，具备药用价值。
43.实施例3、ac115619-22aa多肽对肝癌细胞肿瘤干细胞特性的抑制作用研究
44.ac115619-22aa对肝癌细胞肿瘤干细胞特性的作用使用细胞成球实验观察。实验重复三次，每次重复具体步骤如下：
45.将huh7肝癌细胞(购于武汉普诺赛生命科技有限公司公司，货号：cl-0120)以1万个/孔的密度种植于超低吸附6孔板细胞培养板，加入dmem培养基3ml，实验设多肽处理组和对照组这两个处理组。多肽处理组加入ac115619-22aa水溶液，使其终浓度为400μg/ml，对照组加入等量水溶液(0μg/ml ac115619-22aa)。每个处理组5个孔，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养，持续培养1周后，镜下观察成球情况。
46.实验结果表明，使用400μg/ml ac115619-22aa处理细胞可以有效抑制huh7细胞的成球能力，细胞成球能力减弱，成球尺寸减小(图4)，提示ac115619-22aa抑制了肝癌细胞的干细胞特性。
47.实施例4、ac115619-22aa多肽对肝癌细胞增殖的抑制及对调亡的诱导作用
48.1、ac115619-22aa多肽抑制肝癌细胞的使用浓度研究
49.采用cck-8试剂盒(购于公司上海翊圣生物科技有限公司，货号：40203es60)分析ac115619-22aa多肽对肝癌细胞增殖的抑制作用。实验重复三次，每次重复具体步骤如下：
50.1)配制ac115619-22aa水溶液：用无菌无酶水作为溶剂，ac115619-22aa作为溶质，配制ac115619-22aa水溶液(浓度为8.0mg/ml)。
51.2)将huh7肝癌细胞以5000个/孔的密度种植与96孔细胞培养板，每孔最终液体量为200μl dmem培养基，细胞贴壁后，实验设6个处理组，每个处理组5个孔：
52.①
0μg/ml ac115619-22aa处理组加入200μl dmem培养基，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养48小时；
53.②
50μg/ml ac115619-22aa处理组加入1.25μl ac115619-22aa水溶液+198.75μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为50μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养48小时；
54.③
100μg/ml ac115619-22aa处理组加入2.5μl ac115619-22aa水溶液+197.5μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为100μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养48小时；
55.④
200μg/ml ac115619-22aa处理组加入5.0μl ac115619-22aa水溶液+195.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为200μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养48小时；
56.⑤
400μg/ml ac115619-22aa处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μldmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养48小时。
57.3)1:100的cck-8试剂检测各处理组细胞的活性变化，使用酶标仪检测450nm波长处的吸光度以反应细胞活性。细胞抑制率＝1-(检测时间点吸光度/0h时间点吸光度)*100％。
58.2、ac115619-22aa多肽抑制肝癌细胞的处理时间研究
59.采用cck-8试剂盒(购于公司上海翊圣生物科技有限公司，货号：40203es60)分析ac115619-22aa多肽对肝癌细胞增殖的抑制作用。实验重复三次，每次重复具体步骤如下：
60.1)配制ac115619-22aa水溶液：用无菌无酶水作为溶剂，ac115619-22aa作为溶质，
配制ac115619-22aa水溶液(浓度为8.0mg/ml)。
61.2)将huh7肝癌细胞以5000个/孔的密度种植与96孔细胞培养板，每孔最终液体含量为200μl dmem培养基，细胞贴壁后，实验设4个处理组：
62.①
0小时处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μl dmem培养基，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养0小时即进行检测；
63.②
12小时处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养12小时后检测；
64.③
24小时处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养24小时后检测；
65.④
48小时处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养48小时后检测；
66.⑤
72小时处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养72小时后检测；
67.每个处理组5个孔。
68.3)1:100的cck-8试剂检测各处理组细胞的活性变化，使用酶标仪检测450nm波长处的吸光度以反应细胞活性，数据以0浓度或0时间点进行标准化。细胞存活率＝(检测时间点吸光度/0h时间点吸光度)*100％。
69.结果如图5和图6所示，100μg/ml浓度的ac115619-22aa即可表现出对huh7肝癌细胞较为明显的抑制作用，随着ac115619-22aa多肽浓度增加，对huh7肝癌细胞的存活率逐渐降低；采用400μg/ml的ac115619-22aa多肽处理huh7肝癌细胞，在24h时显示出对huh7肝癌细胞的抑制作用。因此ac115619-22aa多肽具有抗癌活性。
70.3、克隆形成法分析ac115619-22aa多肽对肝癌细胞增殖的抑制作用
71.实验重复三次，每次重复具体步骤如下：
72.1)配制ac115619-22aa水溶液：用无菌无酶水作为溶剂，ac115619-22aa作为溶质，配制ac115619-22aa水溶液(浓度为8.0mg/ml)。
73.2)将huh7肝癌细胞(购于武汉普诺赛生命科技有限公司公司，货号：cl-0120)以1000个/孔的密度种植于6孔板细胞培养板，加入dmem培养基3ml，细胞贴壁后，实验设3个处理组：
74.①
0μg/ml ac115619-22aa处理组加入2000μldmem培养基，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养1周，每天用dmem培养基换液；
75.②
50μg/ml ac115619-22aa处理组加入12.5μl ac115619-22aa水溶液+1975.5μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为50μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养1周，每天用50μg/ml ac115619-22aa的dmem培养基换液；
76.③
400μg/ml ac115619-22aa处理组加入100μl ac115619-22aa水溶液+1900.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培
养箱中培养1周，每天用400μg/ml ac115619-22aa的dmem培养基换液。使用结晶紫染色，观察克隆形成情况。
77.0μg/ml ac115619-22aa处理组最终形成有效克隆125.0
±
12.2个，50μg/ml ac115619-22aa处理组最终形成有效克隆75.6
±
6.2个，400μg/ml ac115619-22aa处理组形成有效克隆0个。提示ac115619-22aa抑制肝癌细胞的克隆形成。
78.其中，dmem+50μg/ml培养基是向dmem培养基中加入上述ac115619-22aa水溶液得到的液体，dmem+50μg/ml培养基中ac115619-22aa的含量为50μg/ml。dmem+400μg/ml培养基是向dmem培养基中加入上述ac115619-22aa水溶液得到的液体，dmem+400μg/ml培养基中ac115619-22aa的含量为400μg/ml。
79.结果如图7所示，400μg/ml浓度的ac115619-22aa多肽有效抑制了肝癌细胞的克隆形成能力，说明ac115619-22aa多肽具有抗癌活性。
80.4、realtime glo annexin v apoptosis assay实时调亡监测试剂盒检测ac115619-22aa多肽对肝癌细胞调亡的诱导作用
81.实时调亡监测试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司公司，货号ja1000)检测ac115619-22aa对肝癌细胞调亡的诱导作用具体步骤如下：
82.1)配制ac115619-22aa水溶液：用水作为溶剂，ac115619-22aa作为溶质，配制ac115619-22aa水溶液(浓度为8.0mg/ml)。
83.2)将huh7肝癌细胞以5000个/孔的密度种植与96孔细胞培养板，每孔最终液体量为200μl dmem培养基，细胞贴壁后，实验设6个处理组，每个处理组5个孔：
84.①
0μg/ml ac115619-22aa处理组加入200μl dmem培养基，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养72小时；
85.②
50μg/ml ac115619-22aa处理组加入1.25μl ac115619-22aa水溶液+198.75μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为50μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养72小时；
86.③
100μg/ml ac115619-22aa处理组加入2.5μl ac115619-22aa水溶液+197.5μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为100μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养72小时；
87.④
200μg/ml ac115619-22aa处理组加入5.0μl ac115619-22aa水溶液+195.0μl dmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为200μg/ml，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养72小时；
88.⑤
400μg/ml ac115619-22aa处理组加入10μl ac115619-22aa水溶液+190.0μldmem培养基，使培养体系中ac115619-22aa的含量为400μg/ml，，置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养72小时。
89.每12h使用生物发光检测仪(帝肯(上海)贸易有限公司，货号spark10m)检测调亡信号。
90.结果如图8所示，50μg/ml浓度的ac115619-22aa处理即可在12h时引起肝癌细胞调亡，随着ac115619-22aa浓度的增加，细胞凋亡更加明显。
91.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。