rGO-FeOOH复合材料在干细胞诱导中的应用

100nm；rgo-feooh膜上的feooh长度为1nm-10μm。
8.优选的，所述rgo-feooh膜由以下方法制备：所述rgo-feooh膜由以下方法制备：在氮气保护下，将fecl2溶液缓慢加入到go溶液中，进行水浴反应；得到rgo-feooh溶液，离心洗涤得到rgo-feooh膜。
9.优选的，所述go溶液的浓度为0.1mm-1m。
10.优选的，所述fecl2溶液是将fecl2·
4h2o溶于超纯水中配置而成；所述fecl2溶液的浓度为0.795 g/ml。
11.优选的，所述fecl2溶液与go溶液的体积比为 2.7：1 。
12.优选的，所述水浴反应的温度为15-50℃。
13.优选的，所述培养体系的制备方法为：将干细胞接种于rgo-feooh膜上，添加干细胞增殖培养液，得到培养体系。
14.优选的，所述干细胞为间充质干细胞，所述间充质干细胞包括脂肪来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、牙髓来源的间充质干细胞或脐带来源的间充质干细胞。本发明的有益效果：（1）本发明的rgo-feooh复合材料，其制备条件温和，无需高温、高压反应条件，无需使用有毒或爆炸性还原试剂，所制备的基底厚度均匀，厚度、大小均可控，利于干细胞的接种和后续的培养。
15.（2）本发明的rgo-feooh复合材料具有良好的生物相容性，能够促进成体干细胞增殖，细胞存活率在98%以上，且能维持成体干细胞的干性。在不施加任何其他诱导因素的前提下，间充质干细胞便可因rgo-feooh复合材料的介导而进行神经分化。
附图说明
16.图1：本发明的rgo-feooh复合材料基底制备流程示意图；图2：（a）实施例1制备的rgo-feooh复合材料基底的扫描电镜图，标尺为200nm；（b）实施例1制备的rgo-feooh复合材料基底的扫描电镜图，标尺为100nm，（c）对比例3制备的rgo-feooh复合材料基底的扫描电镜图，标尺为500nm，（d）对比例3制备的rgo-feooh复合材料基底的扫描电镜图，标尺为100nm，（e）对比例4制备的rgo-feooh复合材料基底的扫描电镜图，标尺为500nm，（f）对比例4制备的rgo-feooh复合材料基底的扫描电镜图，标尺为100nm；图3：cck8活性检测结果；图4：活死染色结果；图5：骨髓间充质干细胞被tcp诱导分化后的扫描电镜图；图6：骨髓间充质干细胞被对比例1制备的rgo薄膜诱导分化后的扫描电镜图；图7：骨髓间充质干细胞被对比例2制备的feooh膜诱导分化后的扫描电镜图；图8：骨髓间充质干细胞被实施例1制备的rgo-feooh膜诱导分化后的扫描电镜图；图9：骨髓间充质干细胞被对比例4制备的rgo-feooh膜诱导分化后的扫描电镜图；图10：荧光定量pcr结果显示接种在不同材料上的骨髓间充质干细胞神经干细胞标志物nestin的表达情况；
feooh膜贴在细胞培养板上，得到培养体系。
24.间充质干细胞增殖培养液的组成为：mem alpha （gibco，8121626）+10vt%胎牛血清+碱性成纤维生长因子 (bfgf，20 ng/ml)。
25.实施例3（1）将先用0.1%明胶包被于实施例1制备的rgo-feooh膜上，以促进胚胎干细胞的贴壁。将10000个胚胎干细胞（购自中科院细胞库）接种于包被0.1%明胶的rgo-feooh膜上，添加胚胎干细胞增殖培养液，得到培养体系；胚胎干细胞增殖培养液的组成为：dmem（高糖）+马血清（hs）l-谷氨酰胺（200mm）mem neaa（10mm）hepes（1m）β-巯基乙醇（55mm）pestlif。
26.对比例1：rgo薄膜的制备称取3.625g的葡萄糖加入到58ml 0.1mm的go溶液中搅拌30min，随后加入77.3μl的氨水（25% w/w）搅拌5min，转移至95℃水浴锅，反应1h，即可得到rgo溶液。抽滤得到rgo薄膜。
27.对比例2：feooh膜的制备取100ml 0.1m fecl3·
6h2o于烧杯中，40℃水解5天，离心洗涤3-5遍即可得到大小均一的纺锤形feooh纳米颗粒。将玻片置于feooh溶液中100℃水热30min，即可得到feooh膜。
28.对比例3：（1）将10ml go溶液（浓度为0.725μm）用超声破碎机超声（200w,10min），随后通氮气20min；（2）将39.75g fecl2·
4h2o溶于50ml超纯水中，抽滤后取50ml纯的fecl2溶液，随后通氮气20min；（3）将上述得到的fecl2溶液缓慢加入go溶液中（fecl2溶液与go溶液的体积比为5:1），于25℃恒温水浴反应48h，得到rgo-feooh溶液，用去离子水洗涤3-5次，稀释后抽滤得到rgo-feooh膜。rgo-feooh膜的扫描电镜图见图2（c）和（d），由于该薄膜fe含量较高，从图中可以看出膜上的feooh分布的并不均匀，且结晶性不好，rgo膜呈块状并非褶皱。
29.对比例4：（1）将20ml go溶液（浓度为2m）用超声破碎机超声（200w,10min），随后通氮气20min；（2）将15.9g fecl2·
4h2o溶于20ml超纯水中，抽滤后取20ml纯的fecl2溶液，随后通氮气20min；（3）将上述得到的fecl2溶液缓慢加入go溶液中（fecl2溶液与go溶液的体积比为1:1），于30℃恒温水浴反应5h，得到rgo-feooh溶液，用去离子水洗涤3-5次，稀释后抽滤得到
rgo-feooh膜。rgo-feooh膜的扫描电镜图见图2（e）和（f），由于go浓度过大，从图中可以看出大部分feooh纳米颗粒被rgo包裹，膜上的feooh结晶性也不好。
30.试验例1将大鼠源骨髓间充质干细胞（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）接种在实施例1制备的rgo-feooh膜基底上，分别培养1、3、5天后，利用cck8染色试剂盒，检查细胞存活率。同时，将大鼠源骨髓间充质干细胞接种在细胞爬片（tcp）、对比例1~4和实施例1制备的薄膜上；通过cck8染色发现：与对比例1制备的rgo薄膜相比，在实施例1制备的rgo-feooh材料基底上生长的细胞增殖率没有很大变化；与tcp和对比例2制备的feooh相比，实施例1制备的rgo-feooh材料基底上的细胞增殖率有显著差异，增值率很低，说明实施例1制备的rgo-feooh膜能控制干细胞增殖，具有很好的生物相容性（图3），图3中细胞相对活性=实验组od/ tcp组（第一天）od *100%。钙黄素-pi细胞活死染色显示在实施例1制备的rgo-feooh膜上生长的细胞均为钙黄素染色阳性（染色为绿色，代表活细胞），而极少细胞为pi染色阳性（染色为红色，代表死细胞）（图4），表明在实施例1制备的rgo-feooh膜上生长的细胞保持良好的生物活性，细胞存活率高达98%以上。说明在实施例1制备的rgo-feooh膜上生长的干细胞具有良好分化潜能，能够很好的维持干细胞的干性；从图3和图4可以看出细胞在对比例3的rgo-feooh膜上存活率并不高，可能是由于铁离子浓度过高，造成细胞铁死亡。
31.试验例2为探讨rgo-feooh膜能否诱导间充质干细胞神经分化，将大鼠源骨髓间充质干细胞（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）接种在实施例1制备的rgo-feooh膜上，同时，将大鼠源骨髓间充质干细胞分别接种在细胞爬片（tcp）、对比例1~4制备的薄膜上。15天后，通过细胞扫描电镜发现，实施例1制备的 rgo-feooh膜上的细胞为典型的神经元样细胞，其他薄膜上的细胞均呈现成纤维样形态，说明大鼠源骨髓间充质干细胞在实施例1制备的薄膜上发生了神经分化（见图5~9）。荧光实时定量pcr结果（见图10~13）表明，只有实施例1制备的rgo-feooh膜组中的细胞表达出较高水平的神经分化，相关基因如图10~13中的nestin、map2、tuj1和gfap所示，且表达升高效果显著。这一结果证实了实施例1制备的rgo-feooh膜介导干细胞的神经分化。从图14亦可以看出只有实施例1制备的rgo-feooh膜组中的细胞后期表达出较高水平神经分化数量。
32.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。