一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法。


背景技术：

2.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是革兰氏阳性模型微生物，具有遗传背景清晰、遗传操作简单、易培养、不易污染噬菌体、不含内毒素和分泌蛋白能力强等诸多优势。同时，其被美国食品和药物管理局(fda)认可为安全(gras)食品级微生物。但是，相比于大肠杆菌遗传转化操作所需的50bp长度的同源臂，枯草芽孢杆菌常用同源臂长度为500-1500bp，这大大增加了整合框构建的难度。若将同源臂长度降低至50bp，则可将同源臂直接使用引物引入，降低整合框构建难度。但目前并未有相关报道，因此，亟需开发针对枯草芽孢杆菌的缩短同源臂的高效同源重组方法。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供了一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，是通过提前在基因组整合表达dna结合蛋白和dna退火蛋白，并使用iptg诱导型启动子进行诱导，再结合枯草芽孢杆菌高效转化方法实现。
4.本发明的第一个目的是提供一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，包括以下步骤：
5.将单链dna结合蛋白和dna退火蛋白整合至枯草芽孢杆菌基因组中，所述单链dna结合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述dna退火蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.具体地，seq id no.1序列为：
7.masrgvnkvilvgnlgqdpevrympnggavanitlatseswrdkatgemkeqtewhrvvlfgklaevaseylrkgsqvyiegqlrtrkwtdqsgqdryttevvvnvggtmqmlggrqgggapaggnigggqpqggwgqpqqpqggnqfsggaqsrpqqsapaapsneppmdfdddipf；
8.seq id no.2序列为：
9.mnqivkftddsglavqvtpddvrryicenatekevglflqlcqtqrlnpfvkdaylvkyggapasmitsyqvfnrracrdanydgiksgvvvlrdgdvvhkrgaacykkageeliggwaevrfkdgretayaevalddystgksnwakmpgvmiekcakaaawrlafpdtfqgmyaaeemdqaqqpeqvraqaeqpvdlqpirelfkpycehfgitpaegmtavcgavgaegmhsmteqqarrarawmeeemaapaveaeyevvdegevf。
10.进一步地，所述单链dna结合蛋白和dna退火蛋白由异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达。
11.本发明的第二个目的是提供一种dna结合蛋白和dna退火蛋白表达盒，所述表达盒中包括来源于大肠杆菌的单链dna结合蛋白以及来源于放线菌噬菌体的dna退火蛋白；其中，所述来源于大肠杆菌的单链dna结合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述来源
于放线菌噬菌体的dna退火蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
12.进一步地，所述dna结合蛋白和dna退火蛋白表达盒中还包括位于单链dna结合蛋白和dna退火蛋白上游的iptg诱导表达框。
13.进一步地，所述iptg诱导表达框包括iptg诱导型启动子和阻遏蛋白laci。该表达盒由异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达，即由异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达为由iptg诱导型启动子和iptg诱导型启动子阻遏蛋白laci调控表达。
14.进一步地，所述iptg诱导型启动子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
15.进一步地，所述阻遏蛋白laci的核苷酸序列如seq id no.4所示。
16.本发明的第三个目的是提供一种高效同源重组的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为出发菌，整合了上述dna结合蛋白和dna退火蛋白表达盒。
17.进一步地，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：将comk蛋白整合至枯草芽孢杆菌中，将该重组菌株制备成感受态细胞后，整合上述dna结合蛋白和dna退火蛋白表达盒，得到所述重组枯草芽孢杆菌。
18.进一步地，编码所述comk蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。具体序列如下：
19.atgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccaga
20.agaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaatt
21.gtcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttc
22.acacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgc
23.ggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatggg
24.aaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaatt
25.ccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaaga
26.tgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattag
27.进一步地，所述comk蛋白通过诱导型启动子调控表达，所述诱导型启动子可为任何适用于宿主的启动子，如本发明中使用的是木糖诱导启动子，通过木糖诱导型启动子p
xyla
调控表达，所述枯草芽孢杆菌宿主基因组上使用木糖诱导型启动子p
xyla
在基因组上过表达一个额外拷贝的comk基因。
28.进一步地，所述木糖诱导型启动子p
xyla
的核苷酸序列如seq id no.10所示。具体序列如下：
29.tttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttg
30.aagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattg
aaataaacatttatttt
31.gtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaa
32.atcaaagggggaaatgacaaatggtccaaactagtgatatctaaaaatcaaagggggaaatgttaaagga
33.ggaaggatcc。
34.进一步地，所述木糖诱导型启动子表达comk蛋白的表达框序列如seq id no.5所示。
35.进一步地，制备成感受态细胞的步骤包括：将整合了comk蛋白的重组枯草芽孢杆菌活化，并接种于pab培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种于新的pab培养基中进行培养，向其中加入木糖，诱导形成枯草芽孢杆菌感受态细胞。本发明中枯草芽孢杆菌dna转化方法是一种极为简易高效的方式，主要是采用pab丰富培养基，通过添加木糖诱导实现高效的dna转化与基因编辑。
36.进一步地，pab培养基的组成为：蛋白胨15-25g/l，酵母粉1-10g/l，牛肉膏1-10g/l，nacl 10-20g/l，kh2po
4 10-20g/l，k2hpo
4 1-10g/l。发明人曾尝试过lb培养基、yn培养基、tb培养基、dm3g培养基、bf培养基等培养基，发现转化效率均远低于pab培养基。
37.进一步地，上述转化方法是通过在菌株对数生长期前期添加3％木糖以实现菌株感受态的诱导。
38.进一步地，所述枯草芽孢杆菌包括但不限于枯草芽孢杆菌wb 600。
39.本发明的第四个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌或dna结合蛋白和dna退火蛋白表达盒在食品、生物领域中的应用。
40.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
41.本发明通过开发一种简易高效且仅需短同源臂的重组枯草芽孢杆菌转化方法，使得同源臂最小缩短至35bp，可直接使用引物引入同源臂，并可实现高效枯草芽孢杆菌基因组整合文库的构建。
42.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
43.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
44.图1为使用iptg诱导型启动子表达dna结合蛋白和不同来源dna退火蛋白时平板上获得的平均转化子数目，其中，
“‑”
为未诱导，“+”为诱导。
具体实施方式
45.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
46.下述实施例中所涉及的材料与方法如下：
47.1、选择的dna结合蛋白为大肠杆菌来源(核苷酸序列如seq id no.1所示)；
48.2、不同来源dna退火蛋白包括：
49.(1)来源于格雷戈里纳特罗菌(natronobacterium gregoryi)的argonaute蛋白(ngago，核苷酸序列如seq id no.6所示)；
50.(2)来源于大肠杆菌λ噬菌体的beta蛋白(核苷酸序列如seq id no.7所示)；
51.(3)来源于铜绿假单胞菌噬菌体(pseudomonas aeruginosa phage)的paprect蛋白(核苷酸序列如seq id no.8所示)；
52.(4)来源于放线菌噬菌体(collinsella stercoris phage)的csprect蛋白(核苷酸序列如seq id no.2所示)。
53.3、重组枯草芽孢杆菌的种子培养及发酵：
54.枯草芽孢杆菌为bacillus subtilis wb600。
55.pab培养基的组成(g/l)：蛋白胨20，酵母粉6，牛肉膏6，nacl 14，kh2po
4 14.8，k2hpo
4 5.2。定容后ph调至6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
56.感受态细胞的制备：将于-80℃保藏的重组枯草芽孢杆菌划线接种于lb培养基平板上，37℃，12h。挑取单菌落到每孔装有1ml pab培养基的24孔板中，37℃、220rpm培养6～8h获得种子液，将种子液以20％的接种量接种到新的pab培养基中，并以6％的比例向种子液中加入50g/l的木糖，同时加入终浓度为0.5mm的iptg，于37℃、220rpm条件下培养2h，诱导形成感受态细胞。向感受态细胞中加入终浓度15％的甘油冻存至-80℃。
57.转化：取100μl感受态细胞至已加入同源重组片段的1.5ml ep管中，混匀，于37℃、220rpm条件下培养1.5h，全部涂布相应的筛选平板。
58.实施例1同源重组框
59.构建方法如下：
60.(1)合成seq id no.9所示的带有350bp同源臂序列的卡纳抗性基因整合框；
61.(2)以其为模板，
62.使用引物35-f：5
’‑
cgattgaaacagaagatcacgctgctgctgaataa-3’与引物35-r：5
’‑
gggtttccgcaaacagccaaactgaaagcatatag-3’扩增出带有35bp同源臂的整合框1；
63.使用引物75-f：5
’‑
cataatatgacagaagaagaagtaaacgcaagac-3’与引物75-r：5
’‑
gtggtatcaaaatgggaaaaggccttcc-3’扩增出带有75bp同源臂的整合框2；
64.使用引物150-f：5
’‑
gaaaatgagtataaatatatgcgcagctgcagc-3’与引物150-r：5
’‑
atcgcgggtgttgaccgcg-3’扩增出带有150bp同源臂的整合框3；
65.使用引物200-f：5
’‑
atgtgaactgcgcaaatccatcttgc-3’与引物200-r：5
’‑
ttctggcgactgccaatgctgtagg-3’扩增出带有200bp同源臂的整合框4；
66.使用引物250-f：5
’‑
gcatgtgattgtcggcaaggactac-3’与引物250-r：5
’‑
gatgaccagtaaaggcattgcagctg-3’扩增出带有250bp同源臂的整合框5；
67.使用引物350-f：5
’‑
gctccagcttatatttatcggtttcttgtatc-3’与引物350-r：5
’‑
tcgtgacatacggaaaagatccagagg-3’扩增出带有350bp同源臂的整合框6。
68.实施例2表达dna结合蛋白和不同来源dna退火蛋白的重组基因工程菌的构建
69.将基因组整合木糖诱导型启动子p
xyla
表达comk蛋白(如seq id no.5所示)的重组菌株制备为感受态后，转化含有表达dna结合蛋白和不同来源dna退火蛋白的dna片段，涂布抗性平板且测序后，获得相应工程菌株。
70.实施例3诱导dna结合蛋白和不同来源dna退火蛋白表达后实现段同源臂高效转化
71.将实施例2构建的重组枯草芽孢杆菌按照上述方式制备感受态后，将实施例1中获得的同源重组框纯化后，按照相同摩尔数比例添加并转化(分别添加：35bp同源臂125ng，75bp同源臂133ng，150bp同源臂148ng，200bp同源臂158ng，250bp同源臂168ng，350bp同源臂188ng)。转化结果如图1所示(ck组为未转入含有dna结合蛋白和dna退火蛋白整合框的枯草芽孢杆菌)，结果显示，当dna结合蛋白选择大肠杆菌来源的单链dna结合蛋白，dna退火蛋白选择来源于格雷戈里纳特罗菌的ngago蛋白、来源于大肠杆菌λ噬菌体的beta蛋白或来源于铜绿假单胞菌噬菌体的paprect蛋白时，在同源臂长度缩短至75bp与35bp时，未获得任何获得转化子，且在所有情况下获得的转化子数量均低于诱导表达csprect与ssb的重组菌株。而添加iptg诱导csprect与ssb表达时，在所有同源臂长度下均可获得最大转化子数目，最大提升至不额外表达重组相关基因对照的4倍。同时，在同源臂长度缩短至75bp与35bp时，仅诱导表达csprect与ssb的重组菌株获得转化子。
72.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。