一种抗病型复合根际促生菌的构建方法与流程

本发明涉及一种抗病型复合根际促生菌的构建方法，属于植物根际促生菌。

背景技术：

1、根际促生菌(pgpr)是一种绿色环保的阻控病害的手段，在促进植物生长的同时能够抑制有害生物。pgpr通过直接(利用性竞争)和间接竞争(拮抗性竞争)等方式抵御病原菌对根系的入侵。前者主要是指pgpr与病原菌争夺根际资源，资源利用效率决定着竞争结果。后者即pgpr利用根际养分资源(如分泌物)产生一些对青枯菌有抑制作用或有毒的物质，使病原菌生长(资源利用效率)受到抑制或者被杀死。

2、目前已有大量pgpr防控烟草病原菌的报道，分别报道了枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等微生物通过植物免疫激发、产生抗生物质等机制，减少烟草病害发生。然而大多数pgpr在温室生防效果较好，施入土壤后无法稳定抵御病原菌对根系的入侵，导致实际防控效果并不好。例如，anuratha等将平板筛选得到的菌株组合直接用于田间试验，其对番茄青枯病的防控率仅为36％左右(anuratha c s,gnanamanickam s s.biologicalcontrol of bacterial wilt caused by pseudomonas solanacearum in india withantagonistic bacteria[j].plant and soil,1990,124:109-116.)。赵雅峰等研究发现枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bcl-8与解盐促生菌产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)rs-5复配菌剂，对棉花立枯病的防病效果仅达到51.06％(赵雅峰,陶晶,武占省,刘燕,李春.组合生防菌与解盐促生菌复配对棉花的促生效应[j].中国农业科学,2010,43(22):4754-4760.)。陈晓斌等在谈到pgpr生防作用的不稳定性及可能的改进策略时提到：pgpr作用不稳定性最重要的原因是pgpr菌株在根部的定殖差异。loper等在研究外源细菌在根系上的散布情况时发现，引入菌的种群大小在不同的根上可能相关几个数量级，因而会出现一些根(或根段)保护不完全或完全受不保护的情况(loper j e,haack,c,schrothm n.availability of iron to pseudomonas fluorescens in rhizosphere and bulksoil evaluated with an ice nucleation reporter gene[j].appl environmicrobiol,1985,49:416-422.和bahme j b.schroth m n.spatial-temporalcolonization pattern of arhizobacterium on underground organs of potato[j].phytopathology,1987,77:1093-1100)；bull等发现菌株2-79在小麦根上的不完全定殖进而导致对小麦全蚀病防治效果下降(bull c t,weller d m,thomasshow ls.relationship between root colonization and suppression of gaeumannomycesgraminis var.tritici by pseudomonas fluorescens strain 2-79[j].phytopathology,1991,81:954-959.)。有必要针对菌种定殖率提升开展研究改进。

技术实现思路

1、基于上述，本发明提供一种抗病型复合根际促生菌的构建方法，通过构建一种对农业绿色生产具有普适性的根际促生菌组合的筛选方法，能够快速筛选出防控效果好的复合根际促生菌，以克服现有技术的不足。

2、本发明的技术方案是：一种抗病型复合根际促生菌的构建方法，包括：

3、针对植物病原菌，筛选出病原菌的拮抗菌；

4、分析植物的根系分泌物，找出主要碳源物质；

5、根据主要碳源物质，分析拮抗菌与病原菌竞争碳源基础生态位宽度及重叠指数，筛选出与病原菌存在营养竞争关系的拮抗菌；

6、利用拮抗菌构建各拮抗菌群落组合，筛选出对病原菌防治效果好的拮抗菌群落组合；

7、检测拮抗菌群落组合和病原菌对不同碳源物质的利用效率，将利用效率优于病原菌和其他组合的拮抗菌群落组合，作为植物根际促生菌的配方。

8、优选地，分析拮抗菌与病原菌竞争碳源基础生态位及重叠指数的方法为：

9、将拮抗菌菌株与病原菌单独用生理盐水洗脱，去除内生碳源，调整od600为0.5待用；

10、在微孔板中分别加入四唑类氧化还原染料和专性培养基，将拮抗菌和病原菌分别接种到微孔板中，设定三个空白，只加四唑类氧化还原染料和专性培养基，拮抗菌和病原菌培养预定时间后测定od600值，其中，所述专性培养基为无机盐培养基与碳源物质混合配置，所述碳源物质为主要碳源物质中的一种；

11、计算拮抗菌与病原菌竞争碳源基础生态位宽度，计算公式如下：

12、

13、式中，pi为物种在资源系列中第i资源位的利用占该种对资源总数利用的比值；s为资源位数；bsw的取值范围为[0，lns]；

14、计算拮抗菌与病原菌竞争碳源生态位重叠指数，计算公式如下：

15、

16、式中，pik、pjk分别为物种i和物种j在第k资源位上的利用占物种在整个资源的总利用的比例；s为资源位数；

17、根据生态位宽度及重叠指数筛选拮抗菌。

18、优选地，采用断棒模型来构建各拮抗菌群落组合，并通过限菌微系统研究植物根际拮抗菌群落组合与病原菌的拮抗效果。

19、优选地，通过限菌微系统研究植物根际拮抗菌群落组合与病原菌的拮抗效果的方法如下：

20、先将植物种子进行无菌催芽后，移植到组培瓶中，浇灌无菌的营养液，将组培瓶放置到光照培养箱中培养；

21、再将不同拮抗菌群落组合接种至限菌微系统中，将病原菌作为入侵者接种到限菌微系统中，培养预定时间后检测植株发病情况。

22、优选地，检测拮抗菌群落组合和病原菌对不同碳源物质的利用效率的方法为：

23、分别将拮抗菌群落组合菌株和病原菌菌株转接到不含碳源的培养基中培养预定时间，再洗涤菌体除去残留的培养基，最后调节od600＝0.5，得到拮抗菌群落组合菌株和病原菌菌株的菌悬液；

24、在细胞培养板中加入单一碳源培养基，并接种菌悬液使初始菌od600值为0.05，培养预定时间后检测菌液od600值，所述单一碳源为主要碳源物质中的一种；

25、以在单一碳源条件下细菌生长的最大生长速率表征细菌对该种碳源的利用效率，瞬时生长速率计算公式如下：

26、μ＝(lnxt2-lnxt1)/(t2-t1)

27、其中，μ、x、t分别指的是瞬时生长速率、0h和预定时间后细菌细胞密度(od600)、时间(h)；

28、综合各碳源的利用效率，筛选出利用效率高的拮抗菌群落组合。

29、优选地，分别统计各拮抗菌群落组合和病原菌对醇类、氨基酸类、糖类、酸类和其他类碳源的利用效率，由此筛选出抗病效果较好的拮抗菌群落组合。

30、本发明的有益效果是：传统的根际促生菌防控，研究重点往往在单株菌株防御能力上，忽略了根际促生菌菌群之间及其与病原菌的交互作用，并且将直接竞争和间接竞争分开考虑，而在复杂的根际生态系统中，这两种竞争方式是错综交叉、相辅相成的，往往营养竞争会影响拮抗效果，拮抗效果中又包含营养竞争。本发明通过将初步筛选出拮抗菌与病原菌做竞争碳源基础生态位及重叠指数分析，筛选出与病原菌存在营养竞争关系的拮抗菌，然后设计拮抗菌群落组合并分析对病原菌的防治效果，检测防治效果好的拮抗菌群落组合和病原菌对不同碳源物质的利用效率，将利用效率优于病原菌和其他组合的拮抗菌群落组合，作为植物根际促生菌的配方，经过这种多层次，以及多角度的筛选，能够筛选出施入土壤后既可以与病原菌竞争营养位点，又能够通过代谢产物阻止病原菌的生长的复合根际促生菌，从可稳定抵御病原菌对根系入侵，切实提高实际防控效果。