用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及基因检测，尤其是涉及用于人微卫星不稳定msi检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用。

背景技术：

1、微卫星(microsatellite)又称短串联重复序列(short tandem repeats，strs)、简单重复顺序，由1～6个核苷酸组成，具有高度多态性，广泛存在于原核及真核生物基因组中，微卫星不稳定性(microsatellite instability，msi)是指由于复制错误(replicationerrors，rer)引起的微卫星dna长度发生改变。其发生主要是参与配对错误修复(mismatchrepair，mmr)的基因功能缺陷而产生一种缺陷蛋白质，因而不能正常的校正复制错误，从而引起微卫星dna的改变，使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。

2、微卫星不稳定性(msi)最开始主要在结直肠癌中进行研究，结直肠癌是世界范围内的第三大癌症，结直肠癌是一种遗传异质性的疾病，肿瘤临床病理特征相同的患者却对治疗有截然不同的反应和生存率。大约15％的结直肠癌存在染色体组不稳定，而染色体组不稳定，是由于不同程度的微卫星不稳定造成的。其中3％左右为家族遗传性(lynch综合征)，又称为遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，hnpcc)，患lynch综合征的人一生中患结直肠癌的可能性最高可达80％，而且其结直肠癌发病年龄提早，平均诊断年龄约45岁。另外12％为散发性。与lynch综合征不同的是，多数散发性msi结直肠癌并不是由错配修复基因体细胞突变导致的，而是因mlhi基因启动子甲基化导致mlhi基因发生表观遗传学沉默所致。虽然msi作为在结直肠癌中治疗的预测标志物还存在许多争议，但是有许多研究已经表明，iii期的结直肠癌病人中，携带msi的病人预后效果要好于无msi的病人。所以，对结直肠癌病人中msi状态进行分析具有重要的临床指导意义。

3、msi分为三类：①高频微卫星不稳定(high-frequency microsatelliteinstability，msi-h)：2个或2个以上微卫星位点不稳定(或检测的大板标记中>30％的位点不稳定)。②低频微卫星不稳定(low-frequency microsatellite instability，msi-l)：只有1个微卫星位点不稳定(10％～30％标记位点不稳定)。③微卫星稳定(microsatellitestability，mss)：无不稳定微卫星位点(<10％标记点不稳定)。

4、1998年，美国国立癌症研究院协作组推荐2个单核苷酸位点(bat-25、bat-26)和3个双核苷酸位点(d2s123、d5s346、d17s250)作为msi检测的标记点，但由于双核苷酸位点具有多态性，在群体中重复单位的数目表现杂合性，为了提高msi检测的准确性，故推荐病理学家从肿瘤组织周围的正常组织或者抽血提取dna与肿瘤组织配对进行msi检测。2004年，新的专家共识意见中推荐5个准单态性的单核苷酸位点(bat-25、bat-26、nr-21、nr-24、nr-27)作为msi检测的标记点。其原因是研究发现单核苷酸标记位点在大部分个体的等位基因中重复单位的数目是相同且恒定，故单核苷酸标记位点可被看作准单态性。因此，采用单核苷酸标记位点进行msi检测，无需对肿瘤组织配对正常组织的dna进行msi检测，不但可以提高msi检测的敏感性，而且降低成本和时间损耗。

5、目前，通过免疫组化(ihc)和pcr检测可以定量分析微卫星的稳定程度。但ihc判读识别dmmr对病理医师要求较高，检测结果在很大程度上受判读人员的主观因素影响，存在一定概率的假阴性和假阳性。另一方面，ihc检测的一抗选择对阳性和阴性的判断至关重要，操作流程难以标准化和规范化，无法保证ihc结果的可重复性，从而大大影响检测结果的判读。而本项目采用多重荧光pcr+毛细管电泳法，是目前公认的检测msi的金标准。此方法通过多重pcr同时对同一个体来源的肿瘤组织和正常组织的微卫星位点进行扩增，再借助毛细管电泳对扩增产物进行dna片段分析。比较肿瘤组织和正常组织的基因图谱，如果肿瘤组织的五指峰相较于正常组织发生了位移，则判定该微卫星位点不稳定。目前广泛使用的是单核苷酸位点检测msi，但检测的灵敏度和准确性仍需进一步提高。

6、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一组更优的人微卫星不稳定状态msi的检测引物，以期望将该检测引物用于pcr联合毛细管电泳方法后，能够快速准确、灵敏度高、特异性好地检出人微卫星不稳定状态msi的不稳定状态，并且能够实现检测通量大，适用机型广，检测结果真实可靠等优点，以满足推广需求。

2、为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了用于人微卫星不稳定msi检测的引物组合物，所述引物组合物包括第一引物对，和，第二引物对至第六引物对中至少一种；

4、所述第一引物对用于检测单核酸位点cat-25，引物对的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示；

5、所述第二引物对用于检测单核酸位点bat-25，引物对的核苷酸序列如seq idno.3和seq id no.4所示；

6、所述第三引物对用于检测单核酸位点bat-26，引物对的核苷酸序列如seq idno.5和seq id no.6所示；

7、所述第四引物对用于检测单核酸位点nr-21，引物对的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示；

8、所述第五引物对用于检测单核酸位点nr-24，引物对的核苷酸序列如seq id no.9和seq id no.10所示；

9、所述第六引物对用于检测单核酸位点nr-27，引物对的核苷酸序列如seq idno.11和seq id no.12所示。

10、在可选实施方式中，每组引物对中至少一条引物的5’端含有荧光标记。

11、优选地，每组引物对的正向引物的5’端含有荧光标记。

12、在可选实施方式中，所述荧光标记选自fam、rox或joe。

13、第二方面，本发明提供了人微卫星不稳定msi的pcr扩增试剂，所述试剂包括前述实施方式任一项所述的引物组合物，和pcr反应体系。

14、优选地，所述pcr反应体系包括dna聚合酶、pcr buffer、mgcl2和dntp。

15、第三方面，本发明提供了人微卫星不稳定msi的pcr扩增试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式所述的pcr扩增试剂和质控品，所述质控品包括阴性质控品、阳性质控品和质控位点检测引物对。

16、优选地，所述阴性质控品包括无核酸酶水。

17、优选地，所述阳性质控品包括细胞系ht-29基因组dna。

18、优选地，所述质控位点包括至少一个五核苷酸重复位点。

19、优选地，所述五核苷酸重复位点包括penta c或penta d。

20、优选地，penta c的检测引物对的核苷酸序列如seq id no.13(acatgaacacactttgcacctg)和seq id no.14(gctacaagagagcattccaac)所示。

21、优选地，penta d的检测引物对的核苷酸序列如seq id no.15(cctggaaggtcgaagct)和seq id no.16(taagaaatatttgcctaacctatg)所示。

22、第四方面，本发明提供了非诊断目的的msi稳定性检测方法，所述检测方法包括使用前述实施方式所述pcr扩增试剂或pcr扩增试剂盒分别对待测样本和对照样本进行pcr扩增，而后依据两种样本扩增产物中单核苷酸位点片段长度变化输出msi稳定性检测结果。

23、优选地，所述pcr扩增试剂或pcr扩增试剂盒中含有第一引物对至第六引物对共计六组单核酸位点检测引物对。

24、优选地，所述pcr扩增试剂盒中含有penta c的检测引物对和penta d的检测引物对。

25、优选地，所述扩增程序为95℃3分钟；95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃30秒；60℃30分钟；4℃∞。

26、在可选实施方式中，两种样本扩增产物中每种单核苷酸位点片段长度变化差异大于2nt时，输出待测样本中该单核苷酸位点不稳定标识。

27、在可选实施方式中，待测样本中不稳定标识数量大于等于2时，输出该待测样本的msi高度不稳定标识。

28、在可选实施方式中，所述待测样本包括疑似病灶组织、疑似病灶细胞、疑似病变外周血、施药后病灶组织、施药后病灶细胞或施药后病变外周血的核酸提取物；

29、所述对照样本包括癌旁组织、健康细胞或健康外周血的核酸提取物。

30、第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述检测方法的如下(a)～(d)中任一项的应用：

31、(a)诊断结直肠癌试剂的开发；

32、(b)诊断结直肠癌试剂的效果评价；

33、(c)治疗结直肠癌药物的开发；

34、(d)治疗结直肠癌药物的药效评价。

35、本发明采用多重荧光pcr技术与毛细管电泳相结合，检测结直肠癌患者微卫星不稳定状态。相比于免疫组化(ihc)，该方法具有所需样本量少、检测方便、经济、快捷、灵敏度高、特异性好、通量大等优点。同时本技术使用了与本技术检测引物对相匹配的质控位点penta c和penta d的检测引物对，随时监测样本是否混合或污染，确保结果的准确可信。该方法有助于临床上结直肠癌患者微卫星不稳定的检测，对于及时干预治疗结直肠癌、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发、相关药物研发都具有重要意义。