一种检测食品中VBNC状态醋酸菌的复苏培养基及方法

一种检测食品中vbnc状态醋酸菌的复苏培养基及方法
技术领域
1.本发明属于微生物快速检测领域，具体涉及一种检测食品中vbnc状态醋酸菌的复苏培养基及方法。


背景技术：

2.醋酸菌得名于它们能够将乙醇氧化成醋酸。然而asaia属细菌与其他醋酸菌不同，它们不能(或只能轻微地)将乙醇氧化为乙酸。asaia属细菌是一种革兰氏阴性发酵菌，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，最佳生长温度为22℃～30℃，在0.35%乙酸和甲醇的培养基上不生长
1.。目前asaia属共有8株菌，分别是asaia bogorensis、asaia siamensis、asaia krungthepensis、asaia lannensis、asaia spathodeae、asaia astilbes、asaia platycodi、asaia prunellae。到目前为止，asaia bogorensis和asaia lannensis可以从热带气候下的花朵和果实、肠道和蚊子的生殖道以及作为机会致病菌从免疫缺陷的儿童和成人血液中分离出来。由于对防腐剂、消毒剂和抗生素的低敏感性，这些细菌经常造成食品的污染，尤其是含糖量较高的饮料。在变质的饮料中，它们形成粉红色或橙色的细胞聚集体，但是无法用普通的培养基分离出来，导致检测结果出现假阴性，asaia细菌对饮料行业的污染已成为一个严重的问题。
3.活的但不可培养(viable but non-culturable ，vbnc)状态是细菌应对外部压力（如饥饿、寒冷）的一种常见生存策略。在1982年，vbnc细胞被发现并呈现后，研究人员发现了不同种类的细菌可以以vbnc状态存在于自然界中，vbnc细菌的特征是不能在传统培养基上形成菌落，但仍然具有代谢活动。vbnc状态使细菌能够逃避常规平板计数方法的检测，对医疗卫生和食品安全构成了潜在的风险。
4.更重要的是该属细菌对人类的健康带来巨大威胁，有报道称asaia属细菌可引起癌症和骨髓移植的患儿发生血液感染以及两例有扩张性性疾病的儿童感染、导致具有慢性疾病和/或内置器械的病人感染等，目前发现大多数引起临床感染的是asaia bogorensis和asaia lannensis，其中asaia lannensis对抗生素的耐药性更强，另外，asaia lannensis和asaia bogorensis无法在mh（mueller
–
hinton broth）肉汤培养基中生长，无法进行敏感性测试，给临床用药带来极大困难，极有可能是asaia lannensis和asaia bogorensis进入vbnc状态导致其无法在普通培养基上生长。虽然目前人们对这些新出现的asaia病原体如何传播给人类知之甚少，但食物可能是最重要的来源。asaia属对饮料的污染以及其引发的临床感染不仅造成严重的经济损失，而且对公共健康构成严重威胁，因此，研究如何准确快速的检出食品中处于vbnc状态的asaia属醋酸菌非常重要。也有研究者对其它进入vbnc状态的细菌进行了复苏培养，但是多数培养基复杂，不易操作，根据我们前期的研究，也不能用来复苏asaia属醋酸菌。因此，食品安全监控需要寻找更加简单、高效的复苏方法以评估食品安全状态。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对含糖量较高的液体食品中污染的vbnc状态醋酸菌难以检出的问题，提高食品中污染微生物的检测准确性，提供一种检测食品中vbnc状态asaia属醋酸菌的复苏培养基及方法，主要通过以下技术方案实现：本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中vbnc状态醋酸菌的复苏培养基。
6.本发明的复苏培养基是先配置as培养基，然后在as培养基中加入emem培养液和/或椰子汁，使得emem培养液体积分数为25%～50%、椰子汁体积分数为25%～50%，或者他们的总和为体积分数25%～50%，所述的as培养基每升含有胰蛋白胨4.0g～8.0g，酵母膏 1.5g～10g，葡萄糖0.5g～8g，余量为水。
7.优选，所述的复苏培养基中含emem培养液体积分数为12.5%～25%、椰子汁体积分数为12.5%～25%。
8.进一步优选，所述的复苏培养基中含emem培养液体积分数为12.5%、椰子汁体积分数为12.5%，或所述的复苏培养基中含emem培养液体积分数为25%、椰子汁体积分数为25%。
9.本发明的第二个目的是提供一种用于检测食品中vbnc状态醋酸菌的方法，其特征在于，取食品样品加入复苏培养基中振荡培养，食品中污染的vbnc状态asaia属醋酸菌即可复苏并恢复生长能力，所述的复苏培养基是先配置as培养基，然后在as培养基中加入emem培养液和/或椰子汁，使得emem培养液体积分数为25%～50%、椰子汁体积分数为25%～50%，或者他们的总和为体积分数25%～50%，所述的as培养基每升含有胰蛋白胨4.0g～8.0g，酵母膏 1.5g～10g，葡萄糖0.5g～8g，余量为水。
10.所述的取食品样品加入复苏培养基，其培养条件是振荡培养是置于28
±
2℃，180rpm培养8h～24h。
11.所述的取食品样品加入复苏培养基中振荡培养，所述的食品样品可以是指含糖量较高，如含糖量大于0.1g/ml的液体食品，如含糖饮料、果汁、蜂蜜水、调味糖浆等。
12.所述的醋酸菌是指asaia lannensis或asaia bogorensis。
13.本发明同现有技术相比，具有以下有益效果：本发明的复苏培养基中的emem培养液是商品化的培养基，其营养丰富，包含了13种氨基酸、12种维生素和5种无机盐，结合胰蛋白胨、酵母膏和葡萄糖可以大大提高vbnc状态微生物的复苏率。
14.本发明的复苏培养基中的椰子汁含有丰富的营养元素，矿物质，挥发性芳香分子，多元醇和小分子多肽，还具有生长促进作用的多元醇和内源激素等成分，能促进微生物的生长。
15.emem培养液和椰子汁非常容易获得，且按比例添加至复苏培养基，配制方法简单，易操作，比其它复苏方法节约时间，且具有较好的复苏效果。
16.本发明相比于以往的复苏方法添加了emem培养液和/或椰子汁，并且发现emem培养液和椰子汁的组合相比于单独的emem培养液或椰子汁具有更好的效果，能够更快的使细菌复苏。
附图说明
17.图1是emem培养液和椰子汁培养基及其混合物复苏vbnc状态asaia lannensis；
图2是emem培养液和椰子汁培养基及其混合物复苏vbnc状态asaia bogorensis；图3是检测vbnc状态asaia lannensis的实施例生长曲线图；图4是检测vbnc状态asaia bogorensis的实施例生长曲线图。
具体实施方式
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
19.椰子汁和emem培养液:椰子汁来源于海南矮树幼嫩椰子（普通水果店有售），将椰子汁取出后，用0.22μm滤膜过滤后，放于-20℃保存，备用。emem培养液购于浙江深瑞生物科技有限公司（2批号：2021072603），于4℃保存，备用。
20.配制as培养基：胰蛋白胨5.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖8.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值7.2，121℃高压灭菌20min。
21.vbnc状态asaia属醋酸菌的诱导：将菌株asaia lannensis和asaia bogorensis接种至as培养基中，置于30℃，180rpm振荡培养4～6h，测od600值为0.08～0.12，取1ml，9000
×
g离心10min，弃去上清，加入无菌水并调节其浓度为1.0
×
108～5.0
×
108cfu/ml，加至含1.0g/l山梨酸钾溶液中混匀，然后放入4℃冰箱进行诱导，每隔7d采用as固体培养基（as培养基中加入琼脂15g/l的琼脂）检测菌落总数，当固体培养基上无菌落生长时，采用live/dead baclight染色法，通过荧光显微镜观察判断细菌的存活状态，被染为红色的细菌为死细菌，被染为绿色的细菌为活细菌，两株醋酸菌分别经山梨酸钾结合低温诱导322d和301d后，荧光显微镜观察，细菌被染色为绿色，表明asaia lannensis和asaia bogorensis已进入了vbnc状态。采用国标方法gb4789.2-2016检测菌落总数，结果没有微生物生长。
22.采用微孔板测试两株vbnc状态醋酸菌的复苏过程，具体方法：首先配置as培养基，葡萄糖8.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母膏10.0g，加蒸馏水至1l，搅拌混匀，调节ph值为7.2，121℃高压灭菌20min。椰子汁和emem培养液分别用0.22μm滤膜过滤除菌后，加入至as培养基中，使其终浓度分别为体积分数25%椰子汁、体积分数50%椰子汁、体积分数25% emem培养液、体积分数50%emem培养液、体积分数12.5%椰子汁+体积分数12.5%emem培养液、体积分数25%椰子汁+体积分数25%emem培养液的复苏培养基，将不同的复苏培养基加至96孔板中，每孔180μl，再加入上述诱导至vbnc状态的两株醋酸菌20μl，放置于酶标仪中30℃培养，每4h测量一次od600，根据测量值绘制生长曲线图，同时提取复苏生长后的两株醋酸菌的总dna，pcr扩增其16s rdna序列后，送基因测序。结果表明（图1和图2），25%椰子汁和25%emem、12.5%椰子汁和12.5%emem的组合能在10h以内复苏两株醋酸菌，较单独的emem培养液或椰子汁具有更快的复苏时间，仅as培养基不能复苏两株醋酸菌；送测序结果比对后，鉴定结果分别是asaia lannensis和asaia bogorensis，表明复苏的菌落为vbnc状态的醋酸菌。
23.以下为采用本发明的复苏方法检测的实施例：实施例1：50%emem培养液复苏调味糖浆中的vbnc状态醋酸菌复苏培养基配制：胰蛋白胨6.0g，酵母膏 3.0g，葡萄糖1.5g，加蒸馏水至1l，混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后，加入过滤除菌的emem培养液，使其终浓度为50%（体积分数），得到50%emem培养液的复苏培养基，备用。
24.取含有vbnc状态醋酸菌的调味糖浆10ml，加入200ml上述含50%emem培养液的复苏培养基，放置于30℃、180rpm振荡培养，在4h、8h、12h、24h、36h、48h、56h、72h分别测od600处
吸光度值，并取100μl涂布于as固体培养基（加1.5%琼脂粉）上。同时采用国标方法（gb4789.2-2016）进行vbnc检测，液体培养采用pcb培养基，固体培养采用pca培养基，结果发现24h后，醋酸菌asaia lannensis和asaia bogorensis均可在复苏培养基上生长，即可被复苏，且可持续传代培养，而国标法72h后未能检出微生物，表明该复苏方法比国标法更快检出调味糖浆中污染的vbnc状态醋酸菌。
25.实施例2：50%椰子汁复苏调味糖浆中的vbnc状态醋酸菌复苏培养基配制：胰蛋白胨6.0g，酵母膏 3.0g，葡萄糖1.5g，加蒸馏水至1l，混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后，加入过滤除菌的椰子汁，使其终浓度分别为50%（体积分数），得到50 %椰子汁的复苏培养基，备用。
26.取含有vbnc状态醋酸菌的调味糖浆10ml，加入200ml上述50%椰子汁的复苏培养基中，30℃、180rpm振荡培养，在4h、8h、12h、24h、36h、48h、56h、72h分别测od600处吸光度值，并取100μl涂布于as固体培养基（加1.5%琼脂粉）上。同时采用国标方法（gb4789.2-2016）进行vbnc检测，液体培养采用pcb培养基，固体培养采用pca培养基，结果发现在12h后，醋酸菌asaia lannensis和asaia bogorensis均可在复苏培养基上生长，即可被复苏，且可持续传代培养，而国标法72h后未能检出微生物，表明该复苏方法比国标法更快检出调味糖浆中污染的vbnc状态醋酸菌。
27.实施例3： 25%emem培养液和25%椰子汁复苏调味糖浆中的vbnc状态醋酸菌复苏培养基配制：胰蛋白胨6.0g，酵母膏 3.0g，葡萄糖1.5g，加蒸馏水至1l，混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后，加入emem培养液和椰子汁，使其终浓度均为25%（体积分数），得到含25%emem培养液和25%椰子汁的复苏培养基，备用。
28.取含有vbnc状态醋酸菌的调味糖浆10ml，加入200ml上述含25%emem培养液和25%椰子汁的复苏培养基中，30℃、180rpm振荡培养，在4h、8h、12h、24h、36h、48h、56h、72h分别测od600处吸光度值，并取100μl涂布于as固体培养基（加1.5%琼脂粉）上，同时采用国标方法（gb4789.2-2016）进行vbnc检测，液体培养采用pcb培养基，固体培养采用pca培养基，结果发现在8h后，醋酸菌asaia lannensis和asaia bogorensis均可在固体培养基上生长，即可被复苏，且可持续传代培养，而国标法72h后未能检出微生物，表明该复苏方法比国标法更快检出调味糖浆中污染的vbnc状态醋酸菌。
29.实施例4：25%椰子汁复苏调味糖浆中的vbnc状态醋酸菌复苏培养基配制：胰蛋白胨4.0g，酵母膏 4.5g，葡萄糖0.5g，加蒸馏水至1l，混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后，加入过滤除菌的椰子汁，使其终浓度为25%（体积分数），得到终浓度为25%椰子汁的复苏培养基，备用。
30.取含有vbnc状态醋酸菌的调味糖浆10ml，加入200ml上述含25%椰子汁的复苏培养基中，30℃、180rpm振荡培养，在4h、8h、12h、24h、36h、48h、56h、72h分别测od600处吸光度值，并取100μl涂布于as固体培养基（加1.5%琼脂粉）上。同时采用国标方法（gb4789.2-2016）进行vbnc检测，液体培养采用pcb培养基，固体培养采用pca培养基，结果发现在12h后，醋酸菌asaia lannensis和asaia bogorensis均可在固体培养基上生长，即可被复苏，且可持续传代培养，而国标法72h后未能检出微生物，表明该复苏方法比国标法更快检出调味糖浆中污染的vbnc状态醋酸菌。
31.实施例5：12.5%emem培养液和12.5%椰子汁复苏调味糖浆中vbnc状态醋酸菌
复苏培养基配制：胰蛋白胨8.0g，酵母膏 1.5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水至1l，混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后，加入emem培养液和椰子汁，使其终浓度均为12.5%（体积分数），获得含12.5%emem培养液和12.5%椰子汁的复苏培养基，备用。
32.取含有vbnc状态醋酸菌的调味糖浆10ml，加入200ml上述含12.5%emem培养液和12.5%椰子汁的复苏培养基中，30℃、180rpm振荡培养，在4h、8h、12h、24h、36h、48h、56h、72h分别测od600处吸光度值，并取100μl涂布于as固体培养基（加1.5%琼脂粉）上。同时采用国标方法（gb4789.2-2016）进行vbnc检测，液体培养采用pcb培养基，固体培养采用pca培养基，结果发现在8h后，醋酸菌asaia lannensis和asaia bogorensis均可在固体培养基上生长，即可被复苏，且可持续传代培养，而国标法72h后未能检出微生物，表明该复苏方法比国标法更快检出调味糖浆中污染的vbnc状态醋酸菌。
33.各实施例vbnc复苏时间如表1所示，生长曲线如图3和图4所示。
34.表1
ꢀꢀ
国标方法与本发明方法检测食品中vbnc状态醋酸菌的比较注：al：asaialannensis；ab：asaiabogorensis；0：未检出；+：有检出。