包含具有细胞受体结合能的肽的微胶囊及包含其的化妆品组合物的制作方法

包含具有细胞受体结合能的肽的微胶囊及包含其的化妆品组合物
1.的分案申请。
2.
3.本说明书揭示具有细胞受体结合能的肽、与上述肽相连接的微胶囊及包含其的化妆品组合物。


背景技术：

4.微胶囊为医药品、涂料、电子产业及化妆品等多种领域中使用的基础技术，尤其是维持有效成分的初期效力的最佳工具，在医药品及化妆品领域中备受瞩目(journal of controlled release，58，9，1999)。
5.但是，含有至今为止被发现的微胶囊的化妆品组合物，适用于人体时，与不使用微胶囊的化妆品组合物相比，不能获得显著改善的效果。
6.据此，最近利用药物传递系统原理，继续开发向靶细胞传递微胶囊的技术。但是，至今为止被发现的是，因微胶囊的分子不稳定性、与靶细胞的结合力问题等，目前为止无法获得满足的效果。
7.现有技术文献
8.(专利文献1)kr 10-1051557b1


技术实现要素：

9.技术问题
10.在一个实施方式中，本发明的目的在于，提供与靶细胞的结合力优秀的肽。
11.在一个实施方式中，本发明的目的在于，向靶细胞正确而稳定地传递有效成分。
12.在一个实施方式中，本发明的目的在于，提供有效成分向皮肤传递的传递力得到改善的化妆品组合物。
13.解决问题的方案
14.在一个实施方式中，本发明提供一种具有细胞受体结合能的肽，上述肽为包含序列号1至3中任一个序列的肽。
15.在一个实施方式中，本发明提供上述肽连接在表面上的微胶囊。
16.并且，在一个实施方式中，本发明提供包含上述微胶囊的化妆品组合物。
17.发明的效果
18.本发明的一实施方式的肽对靶的选择性结合力优秀。并且，本发明的一实施方式的微胶囊，物理化学稳定性优秀。因此，在包含与上述肽相结合的微胶囊的化妆品组合物中，胶囊内包含的有效成分针对靶细胞的传递效率优秀，皮肤状态改善效果优秀。
附图说明
19.图1为确认与本发明的胶囊的靶(靶细胞)的结合力的结果(图1a：胶囊1，图1b：胶囊2，图1c：胶囊3)。
20.图2为处理本发明的胶囊1时，表示胶原蛋白1(图2a)、胶原蛋白2(图2b)及弹性蛋白(图2c)的表达变化的图。
21.图3为使用含有本发明的胶囊的安瓿之后确认眼角皱纹改善效果的图。
22.图4为处理本发明的胶囊(胶囊2)时，表示α-msh的结合抑制能(图4a)和黑色素合成抑制能(图4b)的图。
23.图5为使用含有本发明的胶囊的爽肤水之后确认美白效果的图。
24.图6为处理本发明的胶囊(胶囊3)时，确认角蛋白1(图6a)、角蛋白5(图6b)及丝聚蛋白(图6c)的表达变化的图。
25.图7为使用含有本发明的胶囊的营养霜之后确认皮肤屏障(真皮周密度、皮肤厚度)改善效果的图。
26.图8为表示将本发明的过量的亲水性生理活性物质稳定化在由脂质部形成的多层结构上的微胶囊的示意图的图。
27.图9为表示包含肽的微胶囊的示意图的图。
28.图10为通过本发明的智能封装制造技术制造的浓缩组合物试样的照片。
具体实施方式
29.以下，详细说明本发明。
30.在一个实施方式中，本发明为具有细胞受体结合能的肽，上述肽为包含序列号1至3中的任一个序列的肽。
31.在本说明书中，细胞受体结合能是指可与形成在细胞上的受体相结合的能力。
32.上述序列号1至3的肽的氨基酸序列如以下表1所记载。
33.表1
34.序列号氨基酸序列1ala-lys-ser-thr2glu-gly-his-lys-ile-phe-pro-ser-trp-tyr3ala-asp-gly-ser-pro
35.在上述表1中，ala意味着丙氨酸，asp意味着天冬氨酸，glu意味着谷氨酸，gly意味着甘氨酸，his意味着组胺酸，ile意味着异亮氨酸，lys意味着赖氨酸，phe意味着苯丙氨酸，pro意味着脯氨酸，ser意味着丝氨酸，trp意味着色氨酸，tyr意味着酪氨酸，thr意味着苏氨酸。
36.在一个实施方式中，将上述肽作为靶的细胞可包含黑色素细胞(melanocytes)、角蛋白细胞(keratinocyte)或成纤维细胞(fibro blast)。
37.并且，上述细胞受体可包含成纤维细胞生长因子受体(fibrobl ast growth factor receptor)、整联蛋白受体或黑皮质素受体(melanocortin receptor)。具体地，上述黑皮质素受体可以为黑皮质素1受体(melanocortin 1receptor，mc1r)。
38.在一个实例中，上述序列号1的肽将成纤维细胞作为靶，可与成纤维细胞生长因子
受体相结合。
39.并且，在一个实例中，上述序列号2的肽将黑色素细胞作为靶，可与黑皮质素受体相结合。
40.并且，在一个实例中，上述序列号3的肽将角蛋白细胞作为靶，可与整联蛋白受体相结合，尤其是可与整联蛋白受体的β1家族相结合。
41.在本发明的一实施方式中，上述肽分别与作为靶的细胞或其受体之外的其他细胞不结合，由于其结合力优秀，因此当连接肽与其他成分时，可期待向靶传递的高传递力。
42.在一个实施方式中，本发明为上述肽连接在表面上的微胶囊。上述肽结合微胶囊上的亲水性基，例如结合羧基与肽上的n-末端，可连接在微胶囊上，但是连接方法不受限制，可根据本领域的普通技术人员公知的多种方法。
43.微胶囊可包含广泛而多种的聚合物，这些包含聚合物、热敏感性聚合物、光敏感性聚合物、磁性聚合物、ph敏感性聚合物、盐敏感性聚合物、化学敏感性聚合物、高分子电解质、多糖类、肽、蛋白和/或塑料，但不局限于此。聚合物包含聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pn ipaam)、聚(苯乙烯磺酸盐)(pss)、聚(丙烯胺)(paam)、聚(丙烯酸)(paa)、聚(乙烯亚胺)(pei)、聚(二烯丙基甲基-氯化铵)(pdadmac)、聚(吡咯)(ppy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvpon)、聚(乙烯基吡啶)(pvp)、聚(甲基丙烯酸)(pmaa)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚苯乙烯(ps)、聚(四氢呋喃)(pthf)、聚(苯二甲醛)(pthf)、聚(己基紫精)(phv)、聚(l-赖氨酸)(pll)、聚乙烯醇(pva)、聚(l-精氨酸)(parg)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)之类的物质，但不局限于此。
44.在一个实例中，上述胶囊可为双重层，此时，位于外廓的层可包含聚乙烯醇，位于内面的层可包含聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)。
45.并且，微胶囊可包含在胶囊的外廓层可生成有效中性电荷、负电荷或正电荷的一个以上的物质。某种情况下，胶囊的电荷可有助于防止或促进粒子的凝聚或聚类(clustering)。
46.在一个实施方式中，上述肽基于微胶囊的总截面积，能够以0.1～10peptides/μm2的密度包含，上述肽的密度优选地可以为0.3～8peptides/μm2，最优选地可以为0.4～7peptides/μm2。肽的密度可意味着以微胶囊的单位表面积为基准而存在的肽的条数。
47.例如，上述微胶囊上的肽的密度小于0.1peptides/μm2的情况下，或者大于10peptides/μm2的情况下，呈现类似于不与肽相连接的微胶囊的皮肤状态改善效果，在上述密度范围内具有优秀的与靶细胞相结合的结合力和向靶细胞传递的有效成分传递力。
48.在一个实施方式中，上述微胶囊还包含封入在胶囊内的有效成分，上述有效成分可包含：氨基酸类；植物来源蛋白或其水解物；以及酵母发酵物、其溶解物或其过滤物中的一个以上。并且，作为封入在胶囊的有效成分可包含多种植物提取物和其果实提取物。具体地，上述植物提取物可包含水仙花鳞茎提取物、夏雪片莲鳞茎提取物等，果实提取物可包含火龙果提取物。
49.并且，上述氨基酸类不受限制，可包含精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组胺酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、天冬氨酸等。
50.在一个实例中，上述植物来源蛋白可包含羽扇豆蛋白，上述酵母可包含毕赤酵母
(pichia pastoris)。在一个实例中，上述酵母发酵物可以是毕赤发酵溶解过滤物。
51.在如上的方面上，植物来源蛋白或其水解物和酵母发酵物、其溶解物或其过滤物，基于有效成分的总重量，分别能够以0.0001～30重量百分比包含。当小于0.0001重量百分比时，效果甚微，当大于30重量百分比时，会存在变色和变味等稳定性问题。上述植物来源蛋白或其水解物；酵母发酵物；及其溶解物或其过滤物，基于有效成分的总重量，可分别优选地包含为0.01～30重量百分比，更优选地包含为0.01～25重量百分比。
52.上述氨基酸类可包含为0.00001～0.1重量百分比，优选地可包含为0.0001～0.1重量百分比，更优选地可包含为0.0001～0.05重量百分比，上述植物提取物或果实提取物可包含为0.0001～30重量百分比。上述植物提取物和果实提取物分别可优选地包含为0.001～20重量百分比，最优选地可包含为0.001～15重量百分比。
53.当氨基酸类的含量小于0.00001重量百分比时，功效甚微，当大于0.1重量百分比时，会存在剂型的粘度稳定度的问题。
54.当植物提取物及果实提取物小于0.0001重量百分比时，效果甚微，当大于30重量百分比时，会存在变色、变味及剂型的粘度稳定度的问题。
55.当上述摆列的成分包含在上述含量范围内时，可获得最优秀的保湿、皮肤屏障强化、美白、皱纹改善及皮肤弹性改善效果。
56.在一个实施方式中，本发明为包含上述微胶囊的化妆品组合物。上述组合物可以为保湿用、皮肤屏障强化用、美白用、皱纹改善用或皮肤弹性改善用。
57.在本说明书中，皮肤屏障强化可意味着促进皮肤角质细胞的分化，强化皮肤的最外廓层，改善皮肤状态。
58.在一个实施方式中，上述组合物可促进角蛋白1、角蛋白5、角蛋白10、角蛋白14、丝聚蛋白、兜甲蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白等的合成。
59.在一个实施方式中，上述化妆品组合物内微胶囊的含量可以为0.0001～30重量百分比，优选地可以为0.001～20重量百分比，最优选地可以为0.01～10重量百分比。
60.当化妆品组合物内微胶囊的含量小于0.0001重量百分比时，效果甚微，当大于30重量百分比时，组合物内胶囊的分散度降低，会失去化妆品组合物的粘性。
61.以下，通过制造例和实施例，说明本发明。以下制造例和实施例只是用于说明本发明的，而不得被解释为本发明的权利范围局限于此。
62.[制造例]
[0063]
[制造例1]肽的制造
[0064]
上述表1的序列号1至3的肽利用自动化合成器(peptrex-r48，peptron公司、大田、韩国)，通过fmoc固体-相方法(fmoc solid-phase method)合成。合成的肽通过使用rp柱(资生堂卡赛帕克，shiseido capcell pak)的反相高效液相色谱(reverse-phase hpl c)(prominence lc-20ab，岛津公司(shimadzu公司)，日本)进行纯化及分析，并利用质量分析仪(hp 1100series lc/msd，惠普公司(hewlett-packard公司)，罗斯维尔(roseville)，美国)进行鉴定。
[0065]
[制造例2]微胶囊的制造
[0066]
[制造例2-1]肽未附着微胶囊的制造
[0067]
在额外的溶解槽中投入脂质浓缩部(神经酰胺、胆固醇、氢化卵磷脂)，以70℃加热
而溶解，在额外的溶解槽中投入亲水性生理活性物质部(泛酰醇、棉子糖、烟酰胺、绿茶水)，以45℃加热而溶解，以备用。并且，在装有脂质稳定部的溶解槽中投入上述准备的脂质浓缩部，一边维持50℃，一边使用搅拌器(agitator)，以1500rpm的速度搅拌5分钟，其中投入亲水性生理活性物质部，使用搅拌器(agitator)，以1500rpm的速度搅拌5分钟并均匀化，准备将过量的亲水性活性成分庞大(bulky)地均匀化的第一浓缩相。并且，以50℃的温度维持上述的第一浓缩相，利用搅拌器(agitator)，以低速500rpm搅拌1小时，充分水合(hydration)上述的第一浓缩相。并且，在50℃下，将上述的水合的第一浓缩相投入到高压型乳化机，以9000帕的压力处理2次，使过量的亲水性生理活性物质位于形成在最内相的水相及脂质双重层(bilayer)之间的水相，以纳米大小进行浓缩封装，形成第二浓缩相。并且，在28℃下，在搅拌器(agitator)中，一边以500rpm的速度缓慢搅拌，一边冷却而稳定化，制造肽未结合状态的微胶囊。制造的微胶囊的直径为约0.2微米。
[0068]
[制造例2-2]肽附着微胶囊的制造
[0069]
将制造例1的肽附着于制造例2-1中制造的微胶囊。
[0070]
将肽的n-末端与肽未结合状态的微胶囊表面的羧基相连接，在微胶囊的表面分别附着制造例1的肽。具体地，在2-(n-吗啉)乙磺酸(mes，2-(n-morpholino)ethanesulfonic acid)缓冲液(mes buffered saline，ph 5.5)上，使肽未结合状态的微胶囊进行再悬浮，与1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(edac，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)及n-羟基丁二酰亚胺(nhs，n-hydroxysuccinimide)一起反应约1小时。之后，在约15000rpm下，对微胶囊进行离心分离1小时，去除edac和nhs，激活肽未结合微胶囊的表面。之后，将微胶囊悬浮在约100ml的磷酸盐缓冲液(pbs，phosphate-buffered saline)之后，在室温下，使约0.1g的序列号1的肽与微胶囊进行反应。之后，用pbs缓冲液洗涤，去除未反应肽。序列号2及3的肽也通过与上述相同的方法，调节试剂的给药量，制造与肽相连接的微胶囊。通过茚三酮检测(kaiser test)确认肽是否附着于微胶囊上。并且，利用扫描电子显微镜(jsm-7100f)，测定微胶囊表面上的肽的密度，呈现大约为2peptide s/μm2的密度。
[0071]
与序列号1的肽相连接的微胶囊为胶囊1，与序列号2的肽相连接的微胶囊为胶囊2，与序列号3的肽相连接的微胶囊为胶囊3。
[0072]
[制造例3]微胶囊上的肽密度调节
[0073]
与制造例2相同地制造微胶囊，通过调节肽的给药量来调节微胶囊相的肽密度。根据密度，如下分实验组。
[0074]
表2
[0075][0076]
[实施例]
[0077]
[实施例1]细胞毒性测试
[0078]
在b16黑色素瘤细胞(b16melanoma cell)分别处理每10um的胶囊1～3，确认细胞
生存率。作为对照组，处理曲酸和熊果苷。其结果，处理本发明的胶囊的情况下，细胞生存率几乎没有变化，由此可确认无细胞毒性。
[0079]
[实施例2]与靶细胞的结合选择性(selectivity)测试
[0080]
为了确认各个胶囊1～3除了靶细胞之外是否还与其他细胞相结合，确认了是否与多种的细胞相结合。其结果，可确认胶囊1至3分别与各个靶细胞之外的细胞几乎不结合。
[0081]
[实施例2-1]胶囊1
[0082]
通过荧光免疫法，利用流式细胞仪(flow cytometry，facs)，确认与胶囊1的细胞的结合力。使用的细胞为成纤维细胞(fibrobl asts)和角蛋白细胞(keratinocytes)、淋巴球(lymphocyte)、单核细胞(monocytes)、黑色素细胞(melanocytes)、树突状细胞(dendritic cells)及皮肤神经元(skin neuron)。由测定结果确认，胶囊1和作为靶细胞的成纤维细胞的结合率为约75％，与此相比，与除了靶细胞之外的细胞的结合力显著低(图1a)。
[0083]
[实施例2-2]胶囊2
[0084]
对胶囊2也通过与实施例2-1相同的方法进行实验。其结果可确认，胶囊2呈现与作为靶细胞的黑色素细胞相结合的约70％的结合力，与此相反，与其他细胞的结合率显著低(图1b)。
[0085]
[实施例2-3]胶囊3
[0086]
对胶囊3也通过与实施例2-3相同的方法进行实验。其结果可确认，胶囊3呈现与作为靶细胞的角蛋白细胞相结合的结合率为约85％，与此相反，与其他细胞的结合率显著低(图1c)。
[0087]
[实施例3]与肽相连接的微胶囊的抗老化效果(胶囊1-3)
[0088]
[实施例3-1]成纤维细胞与胶囊的结合力(根据肽是否存在，比较结合力)
[0089]
比较在胶囊表面连接肽的微胶囊和未连接肽的微胶囊与成纤维细胞的结合力和有效成分的吸收力。
[0090]
在4℃下，将胶囊1与靶细胞一起培养1小时，延迟结合过程之后，测定在胶囊表面连接肽的微胶囊和未连接肽的微胶囊与成纤维细胞的结合力。胶囊1与成纤维细胞的结合力比起未连接肽的微胶囊的结合力，约4倍左右优秀。
[0091]
[实施例3-2]胶原蛋白及弹性蛋白生成力比较
[0092]
将在胶囊表面连接肽的微胶囊与成纤维细胞进行反应，观察弹性蛋白和胶原蛋白生成量。
[0093]
使用未连接肽的胶囊时，胶原蛋白生成量很少，与此相反，使用连接肽的胶囊1时，与未连接肽的胶囊相比，胶原蛋白型1和3的生成量增加约1.7倍(图2a，图2b)。
[0094]
就弹性蛋白生成量而言，使胶囊反应之后，经过7天，与肽相结合的胶囊1比起未连接肽的胶囊，呈现最大9倍以上的弹性蛋白生成量(图2c)。
[0095]
[实施例3-3]皮肤皱纹改善品评试验
[0096]
制造相对于总重量包含30wt％的胶囊1的安瓿，无皮肤疾病的35岁～65岁的女性21名，分别将上述安瓿均匀涂抹在整个脸部，如此每天2次涂抹28天，确认眼角皱纹改善程度。其结果可确认大约10％的眼角皱纹改善效果(图3)。
[0097]
[实施例4]连接肽的微胶囊的美白效果(胶囊2-3)
[0098]
[实施例4-1]黑色素细胞和α-msh的结合抑制能
[0099]
分别处理在胶囊表面连接肽的微胶囊(胶囊2)和未连接肽的微胶囊各10um，测定黑色素细胞和α-黑色素细胞刺激激素(msh)之间的结合力。其结果可知，使用胶囊2时，黑色素细胞和α-msh的结合力减少95％以上(图4a)。
[0100]
[实施例4-2]黑色素合成抑制能
[0101]
分别处理在胶囊表面连接肽的微胶囊和未连接肽的微胶囊各10um，比较黑色素的合成量。其结果可知，使用胶囊2时，由黑色素细胞生成的黑色素的生成量大大减少(图4b)。
[0102]
[实施例4-3]皮肤美白效果品评试验
[0103]
无皮肤疾病的35～55岁的女性21名，在整个脸部均匀涂抹包含15％胶囊2的爽肤水，如此每天2次涂抹14天，确认美白效果。其结果，当涂抹包含胶囊2的爽肤水时，可确认显著改善的美白效果(图5)。
[0104]
[实施例5]连接肽的微胶囊的皮肤屏障改善效果(胶囊3-3)
[0105]
[实施例5-1]角蛋白1及角蛋白5及表达增进效果
[0106]
为了察看连接肽的胶囊3的皮肤屏障改善效果，观察到角蛋白的表达增进效果。分别处理在胶囊表面连接肽的微胶囊和未连接肽的微胶囊各10um，确认上述因子的表达程度。其结果，使用胶囊3时，与未连接肽的胶囊的情况相比，角蛋白1及角蛋白5的表达量高出2倍左右(依次为图6a、6b)。
[0107]
[实施例5-2]丝聚蛋白合成增进效果
[0108]
通过与实施例5-1相同的方法处理胶囊，确认丝聚蛋白合成效果。其结果，使用胶囊3时，与未连接肽的胶囊的情况相比，可确认约5倍的丝聚蛋白表达量(图6c)。
[0109]
[实施例6]皮肤屏障强化效果品评试验
[0110]
无皮肤疾病的35～55岁的女性20名，在整个脸部均匀涂抹包含20％胶囊3的营养霜，如此每天2次涂抹14天，确认真皮周密度和皮肤厚度。其结果，涂抹包含胶囊3的营养霜时，真皮周密度和皮肤厚度显著得到改善，由此可确认皮肤屏障改善效果(图7)。
[0111]
[实施例7]基于肽的密度的效果差异
[0112]
对于表2中记载的实验组，相同地进行实施例3至6的实验。当包含胶囊1-3、2-3、3-3时(密度为2peptides/μm2时)的效果为10，各实验组的结果由胶囊1-3、2-3、3-3的相对值表示。
[0113]
表3记录与实施例3的实验对应的实验结果值，表4记录与实施例4对应的实验结果值，表5记录与实施例6对应的实验结果值。
[0114]
表3
[0115][0116]
表4
[0117][0118][0119]
表5
[0120][0121]
其结果可知，肽的密度超过0.1～10peptides/um2范围时，皮肤状态增进效果甚微。
[0122]
[剂型例]
[0123]
[剂型例1]爽肤水(高光用)
[0124]
表6
[0125][0126][0127]
[剂型例2]安瓿(老化改善用)表7
[0128][0129][0130]
[剂型例3]精华露(老化改善用)表8
[0131]
[0132]
[剂型例4]眼霜(老化改善用)表9
[0133][0134][0135]
[剂型例5]乳液(弹性用)表10
[0136][0137]
[剂型例6]营养霜(弹性用)表11
[0138]
[0139][0140]
序列表自由文本(free text)
[0141]
序列号1(ala-lys-ser-thr)是将成纤维细胞作为靶的肽的序列，序列号1的肽可与成纤维细胞生长因子受体相结合。
[0142]
序列号2(glu-gly-his-lys-ile-phe-pro-ser-trp-tyr)是将黑色素细胞作为靶的肽的序列，序列号2的肽可与黑皮质素受体相结合。
[0143]
序列号3(ala-asp-gly-ser-pro)是将角蛋白细胞作为靶的肽的序列，序列号3的肽可与整联蛋白受体相结合，尤其是可与整联蛋白受体的β1家族相结合。