一种制备高纯度核糖霉素的方法与流程

1.本发明属于药物纯化技术领域，更具体涉及一种连续离交的方法，制备高纯度核糖霉素的方法。


背景技术：

2.核糖霉素是链霉素3719作为菌株，通过发酵、提炼得到的碱性水溶性氨基糖苷类抗菌药物，其化学结构式如下所示：
[0003][0004]
核糖霉素抗菌谱广，对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均显示有较强的抗菌活性，对金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等敏感的细菌感染疾患，如败血症、支气管炎、肺化脓症、脓胸、胆道感染、腹膜炎以及泌尿系统感染等均有疗效，与青霉素g、四环素、氨苄青霉素或邻氯青霉素间无交叉耐药性，与卡拉霉素有交叉耐药性，吸收良好，血浓度高，毒性低，耳毒性亦低于其它氨基糖苷类抗生素。
[0005]
目前提纯氨基糖苷类抗生素主要采用的是固定床树脂分离法，该方法生产周期长，并且由于分离产品大多与其杂质结构和特征比较相似、化学极性差值比较小，固定床必须要有足够树脂量才能达到理想分离效果。而树脂量大则会造成固定床占地面积大，活化树脂用酸、碱用量大，树脂利用率低等后果。
[0006]
鉴于此，有必要对核糖霉素的纯化工艺进行改进，制备高纯度核糖霉素。


技术实现要素：

[0007]
为了解决上述问题，本发明提供了一种通过连续离交的方法来制备高纯度核糖霉素的方法。
[0008]
本发明公开了一种制备高纯度核糖霉素的方法，该方法包括以下步骤：
[0009]
步骤(1)、将核糖霉素发酵液稀释后调节ph，稀释后浓度控制在10-15％，上第一连续色谱系统，除去色素和大部分发酵副产物，得到纯度较高核糖霉素一次分离液，使用纳滤或反渗透膜初步浓缩料液，再用蒸汽加热真空薄膜浓缩，浓缩液hplc纯度大于75％；
[0010]
步骤(2)、将步骤(1)的核糖霉素浓缩液稀释后调节ph，稀释后浓度控制在20-25％，上第二连续色谱系统，除去新霉胺等杂质，得到高纯度的核糖霉素解析液，使用纳滤
或反渗透膜浓缩，再用蒸汽加热真空薄膜浓缩，浓缩液hplc纯度大于95％。
[0011]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0012]
本发明提供了一种连续离交分离高纯度核糖霉素的方法，取代现有的固定床分离设备，将现有技术中的固定床的吸附、解析、再生等整个工段中整合在圆盘传送式逆流连续色谱分离系统内，它将原有的固定床中的整段树脂分割成若干段，在原工艺方法传质区前面的那部分树脂重新位于一个或几个小的树脂柱内，这样可以重新进入吸附，洗脱，再生等循环，利用起原来未被起用的部分树脂，树脂利用率就大大提高了，同时还可以减少化学试剂、水等的消耗量。圆盘传送式连续色谱分离系统拥有大量的柱(分离)单元，也使得它们能非常有效地应用于连续分级生产过程。
附图说明
[0013]
图1为第一连续色谱系统的工艺流程图；
[0014]
图2为第二连续色谱系统的工艺流程图。
具体实施方式
[0015]
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。除非说明书中有特殊说明，本发明中组分、原料均采用化学纯级别。另外，各实施例中的“mo l/l”为“摩尔数/体积”；除非特殊说明，离交柱均流速方向均为正向。
[0016]
本发明公开了一种制备高纯度核糖霉素的方法，该方法包括以下步骤：
[0017]
步骤(1)、将核糖霉素发酵液稀释后调节ph，稀释后浓度控制在10-15％，上第一连续色谱系统，除去色素和大部分发酵副产物，得到纯度较高核糖霉素一次分离液，使用纳滤或反渗透膜初步浓缩料液，再用蒸汽加热真空薄膜浓缩，浓缩液hplc纯度大于75％；
[0018]
步骤(2)、将步骤(1)的核糖霉素浓缩液稀释后调节ph，稀释后浓度控制在20-25％，上第二连续色谱系统，除去新霉胺等杂质，得到高纯度的核糖霉素解析液，使用纳滤或反渗透膜浓缩，再用蒸汽加热真空薄膜浓缩，浓缩液hplc纯度大于95％。
[0019]
步骤(1)中核糖霉素发酵液稀释后使用20％硫酸调节ph6～7。稀释后上第一连续色谱系统，除去色素和大部分发酵副产物。所述步骤(1)中使用截留分子量为400以下的纳滤或反渗透膜浓缩至5-10％，操作压力为0.15～0.3mpa，操作温度40℃以下。步骤(1)中用蒸汽加热真空薄膜浓缩至30-35％，操作条件为真空度-0.08mpa以下，操作温度45-65℃，流速100～600l/h。核糖霉素浓缩液使用20％硫酸调节ph6～7。
[0020]
第一连续色谱系统的工艺流程图如图1所示。色谱柱数量为20根，树脂为强碱性阴离子树脂，具体型号为711，树脂孔径为20-50目，树脂形式为季铵型。第一连续色谱系统分为吸附区(20-30％的柱子)、解析区(30-50％的柱子)和活化区(30-50％的柱子)。吸附区柱子连接形式为串联；解析区采用定量浓度的方式洗脱，解析溶剂为0.4～0.6mol/l的氨水；所述活化区为0.5～1mol/l的氢氧化钠和水，1～2mol/l的盐酸和水，1～2mol/l的氨水和水交替活化洗涤。本发明所选择的树脂为强碱性阴离子交换树脂，树脂颗粒直径在1.25mm以下，均匀度95％以上。
[0021]
如图1所示，第一连续色谱系统中的吸附区共3个单元(18-20根)，通过流速控制，3根离交柱串联，原料于18号口上柱吸附，20号出口流出的液体为废液进三废中心处理，由于上料浓度较低，树脂在吸附物料时相当于同时进行洗涤步骤。
[0022]
第一连续色谱系统中的解析区共8个单元(10-17根)，通过流速控制，17号进口用0.5mo l/l氨水解析，出口通过tlc检测为核糖霉素时停止解析。10～16号离交柱使用串联方式进行连接，10号进口用0.5mo l/l氨水解析，16号出口收集解析液，解析液收集、浓缩后进行下一步连续离交，10号出口处取样口通过tlc检测主板点无核糖霉素时停止解析。
[0023]
第一连续色谱系统中的再生区共9个单元(1-9根)，通过流速控制，1～2号串联使用去离子水冲洗；3号使用2mol/l氨水逆向冲洗；4～5号串联使用去离子水逆向冲洗；6号使用2mol/l盐酸逆向冲洗；4～5号串联使用去离子水逆向冲洗；9号使用1mol/l氢氧化钠溶液逆向冲洗。1号出口冲洗至ph为8～8.5，4、7号冲洗至进出口ph相同，3、6、9号用双倍柱体积的酸、氨冲洗后浸泡。
[0024]
步骤(1)进行初步分离高纯度核糖霉素各控制点位均符合要求后即可转动设备，重复进行上述操作。
[0025]
第二连续色谱系统是为了在步骤(1)的基础上再分离高纯度的核糖霉素。色谱柱数量为30根，树脂为弱酸性阳离子树脂，具体型号为hd-2b，树脂孔径为40-80目，树脂形式为胺型，所述第二连续色谱系统分为吸附区、洗涤区、解析区和活化区；所述吸附区柱子连接形式为串联，所述洗涤区溶剂为水和0.11～0.13mol/l的氨水，柱子连接方式为串联；所述解析区采用定量浓度的方式洗脱，解析溶剂为0.11～0.13mol/l的氨水；活化区为1～2mol/l的盐酸和水，1～2mol/l的氨水和水交替活化洗涤。使用截留分子量为400以下的纳滤或反渗透膜浓缩至1-5％，操作压力为0.15～0.3mpa，操作温度40℃以下。用蒸汽加热真空薄膜浓缩至20-30％，操作条件为真空度-0.08mpa以下，操作温度45-65℃，流速200～500l/h。
[0026]
第二连续色谱系统所选择的树脂为强碱性阴离子交换树脂，树脂颗粒直径在0.22mm以下，均匀度90％以上，并将连续色谱分离整个流程30个分离小单元分为四个区域，其工艺流程图如图2所示。
[0027]
第二连续色谱系统中的吸附区共5个单元(27-30、1)，通过流速控制，27～1号串联连接，原料于27号口上柱吸附，1号出口流出的液体为废液进三废中心处理，29号口出口tlc检测需无核糖霉素。
[0028]
第二连续色谱系统中的洗涤区共6个单元，通过流速控制，21～25号串联连接，21号口使用0.12mo l/l氨水洗涤，出口取样tlc检测需无核糖霉素以外杂质。25号出口与28号出口并联连接至29号进口，其目的为洗去与核糖霉素极性差距较大的杂质，防止过多杂质进入解吸区；26号口使用去离子水洗涤，出口与27号出口并联连接至28号进口，其目的为洗去料液调节ph时产生的硫酸盐。
[0029]
第二连续色谱系统中的解吸区共14个单元(3-10和15-20)，分为两部分，通过流速控制，3～10号串联连接，15～20号串联连接，20号出口与5号出口并联连接至6号进口。15、3号口使用0.12mo l/l氨水解吸，15、3号出口tlc检测结果应无核糖霉素，10号出口tlc检测应为合格高纯核糖霉素，出口液收集浓缩后进入下一步工序。
[0030]
第二连续色谱系统中的活化区共5个单元(2、11-14)，通过流速控制，11号使用去
离子水冲洗；12号使用2mo l/l氨水逆向冲洗；13号使用去离子水逆向冲洗；14号使用2mo l/l盐酸逆向冲洗；2号使用2mo l/l氨水冲洗。11号出口冲洗至出口ph为8～8.5，13号冲洗至出口ph为6～7，12、14、2号用双倍柱体积的酸、氨冲洗后浸泡。
[0031]
连续离交过程中，需根据各控制点位tlc结果适当调整流速，以达到系统平衡。分离高纯度核糖霉各控制点位均符合要求后即可转动设备，重复进行上述操作。
[0032]
本发明中，第一连续色谱系统和第二连续色谱系统均采用圆盘传送式逆流连续色谱分离系统。
[0033]
本发明是使用连续离交系统分离高纯核糖霉素，经检测，高纯核糖霉素的hplc纯度远超原有标准，可达98％以上。
[0034]
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。