外源基因导入绞股蓝的方法与流程

1.本发明涉及植物转基因技术领域。更具体地说，本发明涉及外源基因导入绞股蓝的方法。


背景技术：

2.绞股蓝(gynostemma pentaphyllum(thunb.)makino)，属葫芦科(cucurbitaceae)绞股蓝属(gynostemma)多年生草质攀援藤本植物。绞股蓝是目前发现除五加科外还具有人参皂苷结构的少数植物来源之一，具有滋补保健、抗癌防衰、增强体质和改善脂质代谢等多种功能，号称“南方人参”和“不老长寿药草”。人参是一种被广泛应用的草本植物，具有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生长等作用，它的药效成分大部分来自于达玛烷型四环三萜。能够生产达玛烷型皂苷的植物主要集中于人参属，如人参、三七和西洋参，但是它们生产周期一般为3-5年，轮作周期至少10年。如何获得大量的达玛烷型皂苷及其次生苷和苷元成为现代药学研究的重点。而绞股蓝本身具有完整的达玛烷型皂苷合成途径，所有绞股蓝皂苷的苷元部分都为达玛烷型四环三萜类；同时绞股蓝易生长，且不存在人参科植物普遍存在的连作障碍，具备作为生物反应器来合成达玛烷型皂苷的巨大潜力，而建立高效的遗传转化体系是构建生物反应器的必要工作环节。
3.但是，在绞股蓝中导入外源基因难度较大，现有技术中多次报道导入失败，例如广西医科大学的硕士学位论文“三七se基因克隆及转化烟草、绞股蓝的初步研究”在尝试了多种菌液浸泡时间、多种抗生素浓度后，仍未实现绞股蓝基因转化。发明人在对该文献进行重新性试验后，发现确实无法转化，因此在进行大量试验后，发明人将研究起点提前至种子采收环节和外植体选择，并发现种子发芽参数、外植体诱导参数、生根参数、头孢霉素浓度、甘露糖浓度对导入是否成功均具有关键影响，经过调整，终于实现了外源基因导入。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是提供一种外源基因导入绞股蓝的方法，能够成功将外源基因导入绞股蓝，得到绞股蓝阳性植株。
5.为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了外源基因导入绞股蓝的方法，包括：s1：选取采收后3个月内、带种皮的绞股蓝种子，消毒，培养获得种子实生无菌组培苗，或者选取去除叶片的带腋芽茎段，消毒，利用继代增殖培养基培养获得扦插无菌组培苗，所述继代增殖培养基内包括头孢霉素；s2：选取s1得到的种子实生无菌组培苗或扦插无菌组培苗，在生根培养基内培养，得到无菌生根苗，所述生根培养基内包括头孢霉素；s3：将质粒pcambia1301-pmi转入农杆菌内，并在含有卡那霉素和利福平的培养基中培养，培养获得农杆菌重悬液；s4：利用所述农杆菌重悬液侵染s2得到的无菌生根苗，并进行共培养、抑菌培养和筛选培养，得到转基因不定芽。
6.进一步地，在s1中，对采收后3个月内的种子或去除叶片的带腋芽茎段进行消毒的
方法包括：依次用浓度为75％的酒精和浓度为0.1％氯化汞水溶液浸泡。
7.进一步地，在s1中，将消毒后的种子利用诱导培养基进行培养得到种子实生无菌组培苗，所述诱导培养基包括ms培养基、蔗糖和琼脂，每升ms培养基包含蔗糖28g、琼脂5.5g；将消毒后的种子7天24h暗培养，之后以光培养：暗培养＝12h:12h的光照条件培养，光照强度为2000～2500lux。
8.进一步地，在s1中，所述继代增殖培养基包括ms培养基、蔗糖、琼脂、6-苄基腺嘌呤、α-萘乙酸和头孢霉素，每升ms培养基包含蔗糖28g、琼脂5.5g、6-苄基腺嘌呤1.5mg、α-萘乙酸0.02mg、头孢霉素30～200mg。
9.进一步地，在s2中，所述生根培养基包括1/2ms培养基、蔗糖、琼脂、吲哚乙酸和头孢霉素，每升1/2ms培养基中包含蔗糖28g、琼脂5.5g、吲哚乙酸0.2mg、头孢霉素30～200mg。
10.进一步地，在s3中，将含有pcambia1301-pmi农杆菌生长在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep固体培养基上，培养时长为28～48h，挑单菌落，并将单菌落置于含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep液体培养基上振荡培养，至od值为0.8～1.0取出，离心，收集菌体，震荡培养至其od值达到0.4～0.6，获得农杆菌重悬液。
11.进一步地，共培养培养基包括ms培养基、蔗糖、琼脂、6-苄基腺嘌呤、α-萘乙酸，其中，每升ms培养基中含蔗糖28g、琼脂5.5g、6-苄基腺嘌呤1.5mg、α-萘乙酸0.02mg，在黑暗条件下共培养2～4天。
12.进一步地，抑菌培养培养基包括ms培养基、蔗糖、琼脂、6-苄基腺嘌呤、α-萘乙酸和头孢霉素，每升ms培养基中含蔗糖28g、琼脂5.5g、6-苄基腺嘌呤1.5mg、α-萘乙酸0.02mg，头孢霉素30～200mg，在光照条件下抑菌培养5天。
13.进一步地，筛选培养基包括ms培养基、蔗糖、琼脂、6-苄基腺嘌呤、α-萘乙酸和头孢霉素，其中，每升ms培养基中含蔗糖28g、琼脂5.5g、6-苄基腺嘌呤1.5mg、α-萘乙酸0.02mg、头孢霉素30～200mg，甘露糖：蔗糖＝(3～4)：(24～25)。
14.本发明至少包括以下有益效果：
15.1)本发明从绞股蓝种子采收环节和外植体选择开始，通过对种子发芽参数、外植体诱导参数、生根参数、头孢霉素浓度、甘露糖浓度进行调整，不仅能利用绞股蓝的带皮种子作为外植体，成功诱导出绞股蓝无菌组培苗，而且还能以带芽茎段为外植体，成功诱导出无菌组苗，并摸索到合适的芽增殖培养基及生根培养基，成功建立起了绞股蓝的2套组织培养快繁技术体系，为绞股蓝的遗传转化体系的建立奠定了必要的技术基础。
16.2)本发明利用带腋芽茎段为转基因受体材料，用含有表达载体的农杆菌菌液对其进行侵染，使用6-磷酸甘露糖异构酶正向选择标记系统；培养周期短，侵染后培养30-45d后即可进行转化效果检测；总共有288个带腋芽茎段参加侵染实验，最终得到85株植株样品参加dna检测，其中有59个呈阳性，dna检测阳性率为69.41％，估算转化率为20.49％；参加氯酚红检测的58个样品中有31个呈阳性，氯酚红检测阳性率为53.45％，估算转化率为10.76％；参加rt-pcr检测的35个样品中有21个呈阳性，rt-pcr检测阳性率为60％，估算转化率为7.29％；结果显示，转化效果相对稳定，本发明有效克服了以抗生素、除草剂等为负向筛选标记的遗传转化体系转化效率低等缺陷。
17.3)本发明成功将外源基因导入绞股蓝，转化得到绞股蓝阳性植株，为绞股蓝的遗传转化研究领域提供一定的技术参考。
18.4)在继代增殖培养和生根培养阶段，内生菌大量显出，严重影响了无菌组培苗的养护，本发明在继代增殖培养基和生根培养基内添加适当浓度的头孢霉素，成功解决了这一问题，顺利地为后面的遗传转化实验受体材料来源提供了必要的保障措施。
19.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
20.图1为试验1中绞股蓝带皮种子播种后3个月时的组培苗整体生长效果；
21.图2为试验1中绞股蓝带皮种子播种后3个月时的组培苗根生长效果；
22.图3为试验2中绞股蓝带芽茎段外植体在75％酒精(30s)+0.1％升汞(5min)灭菌条件培养30d时的效果图；
23.图4为试验2中绞股蓝带芽茎段外植体在75％酒精(30s)+0.1％升汞(5min)灭菌条件培养60d时的效果图；
24.图5为试验2中绞股蓝纯长柄部位在ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+na a0.02mg/l培养30d时的诱导效果；
25.图6为试验2中绞股蓝带复叶长柄部位在ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l培养30d时的诱导效果；
26.图7为试验2中绞股蓝带短柄单叶片部位在ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l培养30d时的诱导效果；
27.图8为试验2中绞股蓝无柄单叶片部位在ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l培养30d时的诱导效果；
28.图9为试验2中绞股蓝带芽茎段部位在ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l培养30d时的诱导效果；
29.图10为试验3整体植株效果图(培养基：1/2ms+0.2naamg/l)；
30.图11为试验3根部效果图(培养基：1/2ms+0.2naamg/l)；
31.图12为试验3整体植株效果图(培养基：1/2ms+0.2iaamg/l)；
32.图13为试验3根部效果图(培养基：1/2ms+0.2iaamg/l)；
33.图14为试验3整体植株效果图(培养基：1/2ms+0.2iba mg/l)；
34.图15为试验3根部效果图(培养基：1/2ms+0.2iba mg/l)。
具体实施方式
35.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
36.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
37.实施例1：
38.1)种子实生无菌组培苗的获得：
39.选取上一年度12月底至当年1月初采收的新鲜成熟果实，于采收之日起3个月内于通风阴凉处常温保存的种子，并进行前处理：去除果肉及杂质，选取干净饱满的带种皮新鲜
种子，经自来水流水室温冲洗12h时间后，沥干表面水分后，进行表面灭菌：75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3～4次，0.1％氯化汞浸泡时间为5min，无菌水冲洗5～6次，于无菌干滤纸上吸收种子表面水分后，接种于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g,ph＝5.8～6.2的诱导培养基中培养一定时间后，获得种子实生无菌组培苗。
40.2)无菌生根苗的获得：
41.取步骤1)中获得的生长健壮、高1.5～3.0cm的无菌苗，转接入每升1/2ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，吲哚乙酸(iaa)0.2mg，ph＝5.8～6.2的生根培养基中培养，获得无菌生根苗；生根培养基中还包括头孢霉素(cef)30～200mg。
42.3)农杆菌介导的遗传转化：
43.(1)菌种的制备：质粒pcambia1301-pmi通过电转转入到农杆菌内，它的gus基因被目的基因替代。含有pcambia1301-pmi农杆菌lba4404，生长在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep固体培养基上，培养温度为28℃，培养时长为28-48h。挑单菌落，并将单菌落置于10ml含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep液体培养基上振荡培养过夜。转速为200转/分钟，培养温度为28℃，至其od值为0.8-1.0取出，保留菌种备用。
44.(2)预培养：选取长0.8～1.0cm的生长健壮的无菌组培苗长带1节腋芽或顶芽的带芽茎段为受体材料，于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g,6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg,α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8～6.2的培养基中预培养2～3d。
45.(3)工程农杆菌的制备和侵染：
46.工程农杆菌的制备：将3)(1)中制备好的含有质粒表达载体的农杆菌菌液接种于含卡那霉素50mg/l和利福平100mg/l的yep液体培养基中，体积比【菌液：yep液体培养基＝1:(50～75)】，在恒温摇床上以培养温度为28℃，摇床转速为220r/min的条件进行震荡培养过夜，至其od值为0.8-1.0取出，室温下4000转/分钟离心5min收集菌体，旋涡震荡仪将菌体打散后置于重悬液中重悬，在28℃，220转/分钟条件下震荡培养至其od值达到0.4～0.6。
47.侵染及共培养：在超净工作台上，将预培养期满的材料置于制备好的od值0.4～0.6的农杆菌重悬液中侵染10min，取出外植体于无菌滤纸上吸掉附着的菌液，转入每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g,6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg,α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8～6.2的培养基中25℃左右黑暗条件下共培养2～4d。
48.抑菌培养：将共培养期满的外植体接种于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g,6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，头孢霉素(cef)30～200mg，ph＝5.8～6.2的抑菌培养基中，25℃左右光照条件下抑菌培养5d。
49.筛选培养：侵染材料抑菌培养期满后，转入每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g,6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg,α-萘乙酸(naa)0.02mg，头孢霉素(cef)30～200mg，甘露糖：蔗糖＝(3～4g)：(24～25g)，ph＝5.8～6.2的筛选培养基进行筛选培养，获得转基因不定芽。
50.4)转基因植株的氯酚红检测(cpr检测)：取转基因植株的叶片进行氯酚红检测；氯酚红检测试剂为于每升1/2ms培养基含甘露糖2.5g，氯酚红50mg，ph为6.4～7.0，以未添加愈伤组织为空白对照，未侵染植株为阴性对照，常温暗培养24h后观察颜色变化，并进行氯酚红阳性植株比例统计。
51.氯酚红检测方法简单方便，颜色变化易于观察，氯酚红培养基呈玫红色者为阴性植株，呈橙色或黄色者为阳性植株。总共有288个带腋芽茎段参加侵染实验，最终参加氯酚
红检测(cpr检测)的58株待检植株中，有31株呈阳性，阳性率为53.45％，cpr检测估算转化率为10.76％。
52.实施例2：
53.1)扦插无菌组培苗的获得：
54.取室外绞股蓝扦插苗去除叶片的带腋芽茎段为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3-4次后，再用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min，无菌水冲洗5-6次，然后于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8-6.2的继代增殖培养基中培养，获得扦插无菌组培苗；继代增殖培养基中还包括头孢霉素(cef)30～200mg。
55.2)无菌生根苗的获得：
56.取步骤1)中获得的生长健壮、高1.5～3.0cm的无菌苗，转接入每升1/2ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，吲哚乙酸(iaa)0.2mg，ph＝5.8～6.2的生根培养基中培养，获得无菌生根苗；生根培养基中还包括头孢霉素(cef)30～200mg。
57.3)农杆菌介导的遗传转化：
58.(1)菌种的制备：质粒pcambia1301-pmi通过电转转入到农杆菌内，它的gus基因被目的基因替代。含有pcambia1301-pmi农杆菌lba4404，生长在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep固体培养基上，培养温度为28℃，培养时长为28-48h。挑单菌落，并将单菌落置于10ml含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep液体培养基上振荡培养过夜。转速为200转/分钟，培养温度为28℃，至其od值为0.8-1.0取出，保留菌种备用。
59.(2)预培养：选取长0.8～1.0cm的生长健壮的无菌组培苗长带1节腋芽或顶芽的带芽茎段为受体材料，于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8～6.2的培养基中预培养2～3d。
60.(3)工程农杆菌的制备和侵染：
61.工程农杆菌的制备：将3)(1)中制备好的含有质粒表达载体的农杆菌菌液接种于含卡那霉素50mg/l和利福平100mg/l的yep液体培养基中，体积比【菌液：yep液体培养基＝1:(50～75)】，在恒温摇床上以培养温度为28℃，摇床转速为220r/min的条件进行震荡培养过夜，至其od值为0.8-1.0取出，室温下4000转/分钟离心5min收集菌体，旋涡震荡仪将菌体打散后置于重悬液中重悬，在28℃，220转/分钟条件下震荡培养至其od值达到0.4～0.6。
62.侵染及共培养：在超净工作台上，将预培养期满的材料置于制备好的od值0.4～0.6的农杆菌重悬液中侵染10min，取出外植体于无菌滤纸上吸掉附着的菌液，转入每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8～6.2的培养基中25℃左右黑暗条件下共培养2～4d。
63.抑菌培养：将共培养期满的外植体接种于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，头孢霉素(cef)30～200mg，ph＝5.8～6.2的抑菌培养基中，25℃左右光照条件下抑菌培养5d。
64.筛选培养：侵染材料抑菌培养期满后，转入每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，头孢霉素(cef)30～200mg，甘露糖：蔗糖＝(3～4g)：(24～25g)，ph＝5.8～6.2的筛选培养基进行筛选培养，获得转基因不定芽。
65.4)转基因不定芽的pcr检测：剪取待检植株叶片用ctab法提取基因组dna进行pcr检测，检测引物为：pmi1f:5'-cactgcgtgatgtgattgagag-3'(seq id no.1)；pmi1r:5'-cggctggagtagggagaca-3'(seq id no.2)，以质粒pcambia1301-pmi作为阳性对照，未侵染的红腺忍冬愈伤组织为阴性对照，pcr反应体系为：2
×
rapid taq master mix 6μl，引物pmi1r1f(10μm)0.8μl；40ng的dna，用ddh2o补齐至20μl。pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。使用1.7％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳条件：u＝120v，电泳时间：15min，之后凝胶成像系统观察拍照。总共有288个带腋芽茎段参加侵染实验，得到85株待检植株参加pcr检测，其中有59株呈阳性，dna阳性率69.41％，dna检测估算转化率为20.49％。
66.实施例3：
67.1)扦插无菌组培苗的获得：
68.取室外绞股蓝扦插苗去除叶片的带腋芽茎段为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3-4次后，再用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min，无菌水冲洗5-6次，然后于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8-6.2的继代增殖培养基中培养，获得扦插无菌组培苗；继代增殖培养基中还包括头孢霉素(cef)30～200mg。
69.2)无菌生根苗的获得：
70.取步骤1)中获得的生长健壮、高1.5～3.0cm的无菌苗，转接入每升1/2ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，吲哚乙酸(iaa)0.2mg，ph＝5.8～6.2的生根培养基中培养，获得无菌生根苗；生根培养基中还包括头孢霉素(cef)30～200mg。
71.3)农杆菌介导的遗传转化：
72.(1)菌种的制备：质粒pcambia1301-pmi通过电转转入到农杆菌内，它的gus基因被目的基因替代。含有pcambia1301-pmi农杆菌lba4404，生长在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep固体培养基上，培养温度为28℃，培养时长为28-48h。挑单菌落，并将单菌落置于10ml含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的yep液体培养基上振荡培养过夜。转速为200转/分钟，培养温度为28℃，至其od值为0.8-1.0取出，保留菌种备用。
73.(2)预培养：选取长0.8～1.0cm的生长健壮的无菌组培苗长带1节腋芽或顶芽的带芽茎段为受体材料，于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝5.8～6.2的培养基中预培养2～3d。
74.(3)工程农杆菌的制备和侵染：
75.工程农杆菌的制备：将3)(1)中制备好的含有质粒表达载体的农杆菌菌液接种于含卡那霉素50mg/l和利福平100mg/l的yep液体培养基中，体积比【菌液：yep液体培养基＝1:(50～75)】，在恒温摇床上以培养温度为28℃，摇床转速为220r/min的条件进行震荡培养过夜，至其od值为0.8-1.0取出，室温下4000转/分钟离心5min收集菌体，旋涡震荡仪将菌体打散后置于重悬液中重悬，在28℃，220转/分钟条件下震荡培养至其od值达到0.4～0.6。
76.侵染及共培养：在超净工作台上，将预培养期满的材料置于制备好的od值0.4～0.6的农杆菌重悬液中侵染10min，取出外植体于无菌滤纸上吸掉附着的菌液，转入每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，ph＝
5.8～6.2的培养基中25℃左右黑暗条件下共培养2～4d。
77.抑菌培养：将共培养期满的外植体接种于每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，头孢霉素(cef)30～200mg，ph＝5.8～6.2的抑菌培养基中，25℃左右光照条件下抑菌培养5d。
78.筛选培养：侵染材料抑菌培养期满后，转入每升ms培养基中含蔗糖28g，琼脂5.5g,6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，α-萘乙酸(naa)0.02mg，头孢霉素(cef)30～200mg，甘露糖：蔗糖＝(3～4g)：(24～25g)，ph＝5.8～6.2的筛选培养基进行筛选培养，获得转基因不定芽。
79.4)转基因植株的rt-pcr检测：取转基因植株的叶片进一步用rt-pcr方法进行检测；剪取待检植株叶片用trizol法提取总rna，然后用primescript rt试剂盒进行逆转录，得到cdna；检测引物为：pmi1f:5'-cactgcgtgatgtgattgagag-3'(seq id no.1)；pmi1r:5'-cggctggagtagggagaca-3'(seq id no.2)，以质粒pcambia1301-pmi作为阳性对照，未侵染的红腺忍冬愈伤组织为阴性对照，pcr反应体系为：2
×
rapid taq master mix 6μl，引物pmi1r1f(10μm)0.8μl；dna(16ng/μl)2.5μl；用ddh2o补齐至20μl。rt-pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。使用1.7％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳条件：u＝130v，电泳时间：15min，之后凝胶成像系统观察拍照，总共有288个带腋芽茎段参加侵染实验，参加rt-pcr检测的35株植株中有21株呈阳性，rt-pcr检测阳性率为60％，rt-pcr检测估算转化率为7.29％。以下以若干试验具体说明。
80.试验1：种子发芽率实验
81.材料及来源：于上年12月底至当年1月初采收当年新鲜成熟果实，于通风阴凉处阴干后未做任何处理自然放置保存，分别于采收后3个月内，及采收后第7个月、第8个月进行实验。
82.方法：将绞股蓝种子用自来水流水冲洗12h后，将种子分2组处理：第1组：保留种皮，第2组：去除种皮。之后在超净台里对2组种子分别进行如下9组灭菌处理：75％酒精30s+0.1％hgcl2(2min,3min,4min,5min，10min，12min，15min)，之后接种于ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l培养基(ph5.8-6.2)中暗培养7d后转光培养，10d左右萌芽。每一处理3次重复，每一重复4瓶，每瓶接种10粒。接种后第7d记录污染数，接种后第30d记录出芽数。具体试验设计见下表1，结果见表2。
83.上述结果证明，于通风阴凉处晾干后未做任何处理自然放置保存的绞股蓝种子，采收后3个月内接种于培养基上能够发芽，并且以带皮种子发芽为宜，带皮种子经消毒灭菌后于ms培养基中培养10d即开始发芽。而保存半年之后的种子，经消毒灭菌后播种于培养基中及未经过消毒灭菌处理而直接播种于花盆土壤中均迟迟不见发芽。绞股蓝带皮种子播种于培养基中3个月时的组培苗生长效果见下图1。
84.目前绞股蓝组织培养方面常选幼嫩茎段、茎尖、叶片、叶柄及花芽作为外植体经适当的消毒处理后进行愈伤组织及不定丛芽诱导，而以种子材料作为外植体的研究却未见有报道，本试验旨在获得大量转基因受体材料而选用种子为外植体经适当消毒灭菌获得无菌实生苗。
85.试验结果显示，保存半年之后的种子无论是经消毒灭菌后播种于培养基中还是直接播种于土壤中均迟迟不见发芽，与吴小玉等人【吴小玉，彭小列，刘世彪，等.短时低温对绞股蓝种子萌发的促进作用[j].吉首大学学报(自然科学版)，2016，37(4)：29-34.】“一定
的存放时间有利于打破其自身休眠机制，但时间过长种子的萌发率迅速下降，甚至不再萌发”的研究结果相吻合。但采收鲜种后3个月内以带皮种子经75％酒精30s+0.1％ hgcl25min消毒灭菌后于ms培养基中培养，30d后发芽率较高，达45.80％，应尽量在鲜种采收后3个月内及时播种以提高萌发率，降低损失。
[0086]
表1不同灭菌条件对绞股蓝种子灭菌效果及发芽效果的试验设计
[0087][0088]
表2保留种皮及去除种皮的绞股蓝种子在不同灭菌条件下发芽率表现
[0089][0090][0091]
注：1.采用dps6.55统计软件，duncan多重比较法分析，大写字母表1％极显著水
平，小写字母表5％显著水平；
[0092]
2.处理a1-a7为收集鲜种后3个月内播种，处理a8处理、a10为收集鲜种后第7个月播种，处理a9为收集鲜种后第8个月播种。
[0093]
试验2：绞股蓝不同部位外植体芽诱导实验
[0094]
试验2-1：75％酒精(30s)+0.1％升汞(5min)灭菌条件绞股蓝不同部位污染率、成活率及芽诱导率影响
[0095]
方法：将绞股蓝各部位外植体先用自来水漂洗表面灰尘杂质后，再用洗洁精水轻轻刷洗材料表面之后，在超净台里将各部位(叶片、短叶柄、长柄、无芽茎段、带芽茎段)分别用(70％酒精30s+0.1％hgcl
2 5min)进行灭菌处理，之后于培养基
[0096]
ms+6ba1.5mg/l+naa0.02mg/l(ph5.8-6.0)中进行暗培养。每一处理3次重复，每一重复4瓶，每瓶接种8个外植体。接种后第7d时记录污染数和成活数，30d时统计芽增殖倍数，实验结果如下表3。
[0097]
表3 75％酒精(30s)+0.1％升汞(5min)灭菌条件绞股蓝不同部位污染率、成活率及芽诱导率影响
[0098][0099][0100]
注：同一列数据中用dps6.55软件分析，差异显著性用不同字母标注明，小写字母表示0.05差异性显著水平，大写字母表示0.01差异性显著水平，下同。+：一般；++：较好；+++：最好
[0101]
以上数据表明，所选定的叶片、短柄、长柄、无芽茎段及带芽茎段5个部位外植体，经75％酒精和0.1％升汞消毒后，只有带芽茎段能诱导出不定芽，诱导率达59.18％，且新诱导出的不定芽比较健壮，成功获得无菌组培苗，参见图3和图4。
[0102]
试验2-2：
[0103]
为探索绞股蓝不同部位不定芽诱导的情况，以试验1及试验例2-1得出的绞股蓝无菌组培苗的纯长柄(长0.8-1.0cm)、带复叶长柄、带短柄单叶片、无柄单叶片及带芽茎段为不定芽诱导原材料，分别接种于ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l(ph5.8-6.0)中，培养30d时，各部位不定芽诱导效果见下表。
[0104]
表4：绞股蓝不同部位不定芽诱导的情况表
[0105][0106]
上表结果及图5～图9显示，在所选的5个部位中，不定芽诱导率：带芽茎段(99.17％，最高)＞带复叶长柄(9.26％)＞纯长柄(8.33％)＞带短柄单叶片(0)和无柄单叶片(0)；出芽的外植体平均芽数：带复叶长柄(5.67个/株)＞带芽茎段(4.50个/株)＞纯长柄(1个/株)＞带短柄单叶片(0)和无柄单叶片(0)。纯长柄及带复叶长柄虽然也能诱导出不定芽，但诱导率极低，不足10％。
[0107]
试验例2-3：
[0108]
基于试验例2-2的结果，进一步设计实验探索适合带复叶长柄不定芽诱导的培养基。将绞股蓝带复叶长柄(长柄基部垂直插入培养基中)接种于各类培养基中(ph5.8-6.0)，每周对其生长情况观察1-2次，详细记录萌芽起始日，接种30d时统计不定芽诱导效果相关数据。具体实验设计及结果见以下各表。
[0109]
表5：不同种类细胞分裂素对绞股蓝带复叶长柄不定芽诱导效果的实验设计
[0110]
处理编号培养基种类1ms(ck)2ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l31/2ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+naa0.2mg/l4ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba2.0mg/l+kt0.3mg/l5ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba2.0mg/l+ga30.3mg/l
[0111]
不定芽诱导效果如下表所示：
[0112]
表6：不同种类细胞分裂素对绞股蓝带复叶长柄不定芽诱导效果对比
[0113][0114]
结果显示，绞股蓝带复叶长柄在培养基ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l和ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba
[0115]
2.0mg/l+ga30.3mg/l中能够诱导出不定芽，但诱导率均偏低，分别为9.26％和3.92％，＜10％。
[0116]
综合试验例2-1，2-2，2-3可见，绞股蓝不同部位(纯长柄、带复叶长柄、带短柄单叶片、无柄单叶片及带芽茎段)中，不定芽诱导率以带芽茎段最高，为99.17％，出芽的外植体平均芽数4.50个/株；纯长柄和带复叶长柄虽能诱导出不定芽，但诱导率极低，＜10％，与赵瑞强【赵瑞强.三七se基因克隆及转化烟草、绞股蓝的初步研究[d].广西医科大学，2017:15)】的探索结果类似，不适合用于遗传转化的对象，后期的侵染实验对象应选择带芽茎段。
[0117]
试验3：绞股蓝生根效果对比实验
[0118]
方法：以1/2ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l为基本培养基，分别添加iaa0.2mg/l、iba0.2mg/l、naa0.2mg/l，ph5.8-6.0，剪取绞股蓝生长健壮的继代增殖苗2-3cm，接种于以上3种培养基后于培养室中光照培养，探索不同生长素种类对绞股蓝生根效果的影响。共3个处理，每一处理3次重复，每一重复10瓶，每瓶接种3个外植体。分别于接种后第10d、20d、30d时记录统计相关生根指标(生根株数、根长、根颜色、质量等相关指标)，具体实验结果如下：
[0119]
表7不同种类生长素对绞股蓝生根培养期间生根效果的影响
[0120][0121]
注：同一列数据中用dps6.55软件分析，差异显著性用不同字母标注明，小写字母表示0.05差异性显著水平，大写字母表示0.01差异性显著水平，下同。+：一般；++：较好；+++：最好
[0122]
从图10～15可见，绞股蓝在3种培养基中生根效果表现差异极大，详见表中备注栏。培养30d后，3种培养基(naa0.2mg/l、iaa0.2mg/l、iba0.2mg/l)中生根率均达到100％；平均根条数为(naa0.2mg/l，55.28条/株)＞(iba0.2mg/l，31.09条/株)＞(iaa0.2mg/l，17.78条/株)，且差异达极显著；平均根长为(iba0.2mg/l，1.94cm)＞(iaa0.2mg/l，1.69cm)＞(naa0.2mg/l，1.44cm)；另外发现，叶片的展开及健壮程度为(iaa0.2mg/l)≈
[0123]
(iba0.2mg/l)＞(naa0.2mg/l)。
[0124]
综上可知，3种培养基中较适合绞股蓝生根壮苗的培养基为1/2ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+iaa0.2mg/l。
[0125]
试验4：抑菌剂头孢霉素(cef)适宜浓度的摸索实验
[0126]
方法：以ms+蔗糖28g/l+琼脂5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l为基本培养基，分别添加头孢霉素(cef)(0，50，100，150，200)mg/l，共5个处理的筛选培养基，ph5.8-6.0。剪取生长健壮的绞股蓝继代组培苗带1节腋芽(或顶芽)茎段(长1.0-1.5cm)，以形态学上端朝上接种于上述培养基中，共5个处理。每一处理设3次重复，每一重复接种6瓶，每瓶接种8个外植体，培养1个月后观察并记录其长势(成活数、株高、发芽数、颜色等相关指标)。以探讨抑菌效果较适合的头孢霉素浓度。具体实验结果如下：
[0127]
表8抑菌剂头孢霉素(cef)不同浓度对绞股蓝带1节腋芽(或顶芽)茎段农杆菌侵染的不定芽诱导效果的影响
[0128][0129]
上表结果显示：随着头孢霉素浓度的增加，出芽外植体的芽数平均值先升高后降低，呈抛物线趋势，头孢霉素150mg/l条件下，外植体芽诱导率100％，出芽外植体的芽数平均值高于其它4个处理，为5.00个/株，芽高2.77cm，呈绿色；头孢霉素200mg/l条件下，外植体芽诱导率100％，出芽外植体的芽数平均值4.66个/株，仅次于头孢霉素150mg/l，其芽高3.58cm，最优，呈绿色。结论：头孢霉素150-200mg/l为较优的抑菌浓度。
[0130]
试验5：甘露糖筛选浓度的摸索实验
[0131]
方法：剪取生长健壮的绞股蓝继代组培苗带1节腋芽(或顶芽)茎段(长1.0-1.5cm)，以形态学上端朝上接种于甘露糖筛选培养基中。筛选培养基以ms+琼脂
[0132]
5.5g/l+6-ba1.5mg/l+naa0.02mg/l为基本培养基，共进行2轮筛选，第1轮筛选在基本培养基中添加甘露糖/蔗糖(0/28，4/24，8/20，12/16，16/12，20/8，24/4，28/0)g/l中，共8个处理；第2轮筛选在基本培养基中添加甘露糖/蔗糖(0/28，1/27，2/26，3/25，4/24)g/l，共5个处理。每一处理设3次重复，每一重复接种6瓶，每瓶接种8个外植体，接种完成后置于培养室的培养架上培养，每周观察1-2次，培养1个月后观察并记录其长势(成活数、株高、发芽数、颜色等相关指标)。以探讨适合的甘露糖筛选浓度，具体试验结果见下表6和表7。
[0133]
表9第1轮不同浓度甘露糖对绞股蓝芽诱导效果的影响
[0134]
[0135]
表10第2轮不同浓度甘露糖对绞股蓝芽诱导效果的影响
[0136][0137]
由成活率和芽诱导效果表现可见，第1轮筛选的8个处理中，以甘露糖/蔗糖＝4/24(g/l)为未侵染的绞股蓝不定芽筛选效果较适宜选择，此时的出愈率为0，成活率为45.69％，外植体芽诱导率为23.75％，出芽的外植体平均芽数为1.10个/株，芽平均高度为0.28cm，新出的芽为淡绿色，质量一般。
[0138]
第2轮筛选的5个处理中，甘露糖/蔗糖＝2/26(g/l)时，出愈率为61.11％，成活率为100％，外植体芽诱导率为86.12％，出芽外植体平均芽数为2.26个/株，芽平均高度为1.01cm，新出的芽为淡绿色，质量一般。基于上述实验发现，在甘露糖浓度在2g/l和3g/l之间有个临界点影响着绞股蓝农杆菌侵染的愈伤组织和不定芽芽诱导的相关指标。
[0139]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。