一种基于小菜蛾成虫基因组DNA的粗提筛选PxPolycalin纯合突变品系的方法

一种基于小菜蛾成虫基因组dna的粗提筛选pxpolycalin纯合突变品系的方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉一种基于小菜蛾成虫基因组dna的粗提筛选pxpolycalin纯合突变品系的方法。


背景技术：

2.基因组dna实生物遗传信息的载体，也是分子生物学研究的基础。以基因组dna为模板，通过pcr扩增获得目的基因基因组dna信息是研究基因结构和功能的不可或缺的步骤。
3.目前已有大量关于基因组dna提取的方法，但现有技术都存在或多或少的不足，尤其是无法满足大量样本的基因组提取实验。
4.市场上现有的基因组dna提取技术主要是使用试剂盒，虽然在一定程度上简化了操作步骤，但整个提取过程仍略显繁琐，更适用于少量样本基因组dna的提取，无法满足大量样本的基因组dna提取实验的需求。基于crispcr/cas9技术筛选基因纯合突变品系，需要大量提取基因组dna，因此，开发一种可满足上述实验需求的大量基因组dna提取的方法成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.为了满足上述实验需求，本发明提供了一种基于小菜蛾成虫基因组dna的粗提筛选pxpolycalin纯合突变品系的方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
7.一种基于小菜蛾成虫基因组dna的粗提筛选pxpolycalin纯合突变品系的方法，包括如下步骤：
8.1)注射sgrna和cas9蛋白混液至15min内产的小菜蛾卵中；
9.2)待其正常羽化后与野生型品系进行交配，提取已产卵的g0代亲本成虫基因组dna粗提液，并进行pcr扩增、测序；
10.3)选择有突变的g0代子代(g1代)进行自交，保留亲本(g1代)突变类型一致的g2代个体即为纯合突变品系。
11.进一步的，步骤1)中sgrna的设计满足5
′‑
n20ngg-3
′
的原则，cas9蛋白采购至南京金斯瑞生物公司；两者混匀后，37℃孵育20min，再用于注射。
12.进一步的，步骤2)中已产卵的g0代亲本成虫基因组dna粗提液的提取方法如下：
13.a)将已产卵的g0代亲本小菜蛾成虫置于液氮速冻，用组织破碎仪进行破碎；
14.b)向步骤a)中加入裂解液、dna提取酚和核酸抽提试剂，4℃孵育预设时长后离心取上清；
15.c)分别用上清液两倍体积的无水乙醇和75％的酒精清洗一遍；
16.d)弃上清液静置数分钟后添加30μl ddh2o，所得浓液即为基因组dna。
17.优选的，步骤a)中破碎仪转速为22r/s，破碎时间1.5min。
18.优选的，步骤b)中裂解液的用量为200μl；dna提取酚和核酸抽提试剂的用量均为100μl。
19.进一步的，所述裂解液包括1m tris-hcl(ph 8.0)，0.5m edta(ph8.0)，10％ sds和5mol nacl。
20.优选的，步骤b)中的离心速度为12000rpm，时间为2min；孵育时间大于10min。
21.优选的，步骤c)的清洗过程具体为：将两倍体积的无水乙醇和75％的酒精混匀后12000rpm离心1min。
22.进一步的，步骤2)中pcr扩增、测序的步骤具体如下：
23.a)以已产卵的g0代亲本成虫基因组dna粗提液为模板，针对目的基因进行pcr扩增；
24.b)pcr产物送至上海生科生物公司进行测序，比对测序结果以确定成虫的基因型。
25.进一步的，pcr反应的体系为：2
×
hieff pcr master mix 12.5μl，正反向引物各1μl，模板1-3μl，体系总体积为25μl，不足的用ddh2o补足。
26.更进一步的，本发明可以适用于除小菜蛾外的其他昆虫，也可以是除成虫之外的其他发育阶段或组织。
27.发明的有益效果在于：
28.本发明操作简单，大幅减少了小菜蛾成虫基因组dna提取实验所用的时间，适用于大量昆虫样本的基因组提取。更重要的是，本发明所用试剂，成本低廉，容易配制，保存方法简单，对操作人员友好，适宜进一步推广应用。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为pxpolycalin基因dna上sgrna识别位点的选择示意图。
31.图2为基于杂交的目的基因的纯合突变品系的筛选策略示意图；
32.图3为利用本发明的方法提取小菜蛾成虫基因组dna后pcr扩增电泳的胶图(随机挑选4次提取的基因组dna，每次随机挑选3个个体进行pcr)；
33.图4为crispr/cas9介导的pxpolycalin基因的突变示意图。
具体实施方式
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1、小菜蛾成虫基因组dna的提取：
36.1.裂解液配制
37.称取29.22g nacl(索莱宝，s8210),加入90ml蒸馏水，定容至100ml；量取100ml 10％ sds(索莱宝，s1010)溶液；量取100ml 0.5m edta(ph8.0)(索莱宝，e1170)；量取200ml 1m tris-hcl(ph 8.0)(索莱宝，t1150)；最后用蒸馏水定容至1000ml，常温保存备用。
38.2.实验方法
39.(1)材料处理：取已经交配且产卵的小菜蛾成虫一头，置于1.5ml离心管中，并加入一颗钢珠；盖紧离心管盖后置于液氮中预冷数秒；然后置于组织破碎仪中进行振荡破碎，速度为22r/s，时间1.5min。
40.基因组dna提取：向破碎后的成虫组织中加入200μl裂解液，100μl dna提取酚(索莱宝，t0250)和100μl核酸抽提试剂(索莱宝，p1014)。振荡10s后冰浴10-15min。12000rpm离心2min。取上清液(约200μl)转移至新的1.5ml离心管中，加入上清液两倍体积的无水乙醇沉淀dna。12000rpm离心1min。弃上清，保留沉淀dna，加入同样体积的75％酒精。12000rpm离心1min，弃废液。56℃干燥10-20min后，加入30μl ddh2o溶解dna。
41.实施例2、pcr扩增并测序验证小菜蛾成虫基因型：
42.以实施例1中提取的小菜蛾基因组dna为模板，针对小菜蛾pxpolycalin基因(如序列表seq id no.1所示)，设计特异性引物(表1)，进行扩增。pcr反应体系如表2所示。pcr扩增程序如表3所示。
43.pxpolycalin基因，具体如下：
44.ttcacgactacaacatggaacgaggtgggccgcacccgcgccaatgtgctgccaggcggcgcgtgctcgaacctcggcttcaaggccgccaccgccgggacctacgacgcctcatacaaggtggtagagaagaacttcccagtactgtcgactgggaccctcagcacccccagtgcgagtgagccggctaaactgaagctcagtttggatgggaccggtacgtctatttcaaaacattgtgtatattaaaatatacctactaaactcacgagcaatg
45.表1.pcr扩增所用引物
[0046][0047]
表2.pcr反应体系
[0048][0049]a采购至上海翊圣生物科技有限公司，货号：10102es
[0050]
表3.pcr扩增程序
[0051][0052]
2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，电泳结果见图3。pcr产物送至上海生工生物技术公司进行测序验证成虫基因型。
[0053]
实施例3、基于crispr/cas9技术的目的基因突变的纯合品系的筛选：
[0054]
利用crispr grna设计工具(https://www.atum.bio/ecommerce/cas9/input)，根据5'-n20ngg-3'(下划线为pam序列)的原则，在小菜蛾polycalin基因的2号外显子区域筛选了一个sgrna识别位点，为5'-cacccccagtgcgagtgagccgg-3'(图1)。经过cas-offinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)分析后，发现候选靶点没有潜在的脱靶效应
[0055]
利用南京诺唯赞公司的高保真酶“phanta max super-fidelity dna polymerase，货号：p505”进行pcr扩增，制备sgrna体外转录模板。pcr扩增的引物如表4。反应体系如表5。反应程序如表6。
[0056]
表4.sgrna体外转录模板制备所用引物
[0057][0058]a下划线为sgrna识别位点
[0059]
表5.sgrna体外转录模板制备的反应体系
[0060][0061]
表6.sgrna体外转录模板制备的反应程序
[0062]
[0063][0064]
用胶回收试剂盒“gel extraction kit，omega，货号：d2500”对胶收产物进行胶回收。回收得到的dna即为sgrna体外转录模板。
[0065]
利用体外转录试剂盒“t7 quick high yield rnasynthesis kit，neb，货号：e2050s”，按照表7中所述体系，配制反应液，置于37℃，转录过夜反应结束后，按照反应液：dnase i＝15:1的比例，加入1μl dnase i，混匀后，置于37℃孵育30min，以去除dna模板。
[0066]
表7.sgrna体外转录的反应体系
[0067][0068]
利用酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提的方法，纯化体外合成的sgrna。具体步骤为：往上述反应液中加入290μl nuclease-free water并混匀；加入300μl的酚：氯仿：异戊醇，颠倒混匀后，静置2-3min，4℃，14000rmp离心5min；取上清(约250μl)，转移至新的nuclease-free的1.5ml离心管中，加入1/10上清体积的3m的醋酸钠(ph 5.2)和两倍体积的无水乙醇；颠倒混匀后，-20℃静置30min以上；4℃14000rpm离心15min；弃上清，加入1ml预冷的75％酒精；4℃14000rpm离心15min；弃上清，开盖挥发3-5min；加入10μl nuclease-free water进行溶解；测定纯化后sgrna浓度，并使用2％琼脂糖凝胶电泳检测sgrna质量。
[0069]
本发明中使用的cas9蛋白采购至南京金瑞斯公司，货号：z03388。
[0070]
根据图2中所示的纯合突变品系的筛选策略，将注射了sgrna和cas9蛋白混合液后存活的g0代个体成虫与野生型g88品系进行杂交；待其产卵后，按照实施例1中的基因组dna提取方法提取g0代成虫的基因组dna，并按照实施例2中的pcr扩增及检测方法检测亲本基因型。
[0071]
注射液的体系为300ng/μl cas9蛋白，200ng/μl的sgrna，使用nuclease-free water补足至10μl。
[0072]
提取交配后产卵的成虫基因组dna，pcr并电泳(图3)后测序，选择有突变的g0代子代(g1代)进行自交，保留亲本(g1代)突变类型一致的g2代个体即为纯合突变品系。本发明中pxpolycalin基因最终获得两种纯合突变品系，如图4。
[0073]
本发明提供的筛选纯合突变品系的方法操作简单，大幅度减少了实验所用的时间，适用于大量昆虫样本的基因组dna提取，尤其是基于crispr/cas9技术筛选基因组纯合突变品系。此外，本发明所用到的试剂成本低廉，容易配制，保存方法简单，对操作人员友好。本发明的方法实用性广，能应用于多种昆虫不同组织/发育阶段基因组dna的提取。
[0074]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者
替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。