一种检测甲型H7N9禽流感病毒的方法与流程

一种检测甲型h7n9禽流感病毒的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测甲型h7n9禽流感病毒的方法。


背景技术：

2.甲型h7n9禽流感病毒(avian influenza a(h7n9)virus)基于两种表面蛋白，即血凝素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)进行亚型分类，该病毒是一种新的重组病毒，具有与人类受体结合的能力，可侵入人下呼吸道和肺细胞的上皮细胞，并在哺乳动物中复制。h7n9病毒导致的流感具有潜伏期短和高死亡率等特点，严重威胁人类生命安全。早期诊断对控制疾病传播、改善患者的预后以及降低医疗费用至关重要。因此，建立可靠、灵敏、快速的h7n9病毒检测系统是十分有必要。
3.目前检测h7n9病毒主要包括三种方法：(1)病毒分离和培养；(2)血清中相关抗原的检测(比如利用酶联免疫吸附试验检测抗原)；(3)病毒核酸的检测。近年来，临床中主要通过核酸检测h7n9病毒，传统的检测方法为定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcript polymerase chain reaction，qrt-pcr)。但因需要特定的检测设备、耗时较长、需要经专业培训操作人员以及特殊规划的实验室，基层医院很难满足条件。最近，有一些关于h7n9检测的新方法的研究报道，如侧流式试纸重组酶聚合酶扩增(lateral flow dipstick recombinase polymerase amplification，lfd-rpa)需要特殊载体，技术优化门槛较高。逆转录-环介导的等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,rt-lamp)引物设计比较繁琐，筛选到合适的引物比较困难。逆转录-液滴数字pcr(reverse-transcription droplet digital pcr,rt-ddpcr)虽然灵敏度高，但需用到昂贵的设备，不利于现场检测。
4.化学发光(chemiluminescence，cl)检测技术完全避免了高荧光信号的背景和容易淬灭的特性，成为生物分析研究与开发最重要的领域。此外，抗体的cl信号与典型的辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(alp)和磁珠(mbs)平台已被完美地应用于商品化的免疫分析诊断试剂盒，有效的解决了临床问题。
5.目前，使用crispr-cas13a系统与cl和mbs联用尚未见报道，更未见将其应用于h7n9病毒的检测。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测甲型h7n9禽流感病毒的方法，通过crispr-cas13a系统与cl和mbs联用，来提高检测的灵敏度，并降低荧光信号背景。
7.本发明针对h7n9 ha/na rna的特征，提供了一种检测甲型h7n9禽流感病毒的特殊检测方法，通过逆转录-重组酶介导扩增(rt-raa)，常温扩增靶标rna，结合cas13a-mb-cl进行信号放大和检测，无需对病毒rna进行预处理，大大节约时间和成本，仪器依赖性低，恒温即可扩增，同时特异性强，操作简便，增加了临床适用性。
8.技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.本发明提供了一种检测甲型h7n9禽流感病毒的方法，利用rt-raa-cas13a-mb-cl放大碱性磷酸酶的化学发光信号检测核酸。
10.本发明通过逆转录-重组酶介导扩增rt-raa，常温扩增靶标rna，结合cas13a-mb-cl进行信号放大和检测。图1为用于核酸检测的rt-taa-cas13a-mb-cl平台示意图：用逆转录-raa法扩增目标rna，氨基化的rna探针通过生物素标记的sa-alp与mbs-cooh偶联，cas13a在crrna降解rna探针的指导下与靶rna结合，释放alp，加入cdp-star后产生cl信号。
11.具体地，本发明检测方法包括以下步骤：
12.(1)iptg诱导lwcas13a蛋白的表达和纯化；
13.(2)rna标准品和crrna的制备；
14.(3)mb-rna-ap复合物的制备；
15.(4)用crispr-cas13a mbs系统检测ha或na基因的rna；
16.(5)通过外部磁场分离溶液，加入alp底物cdp-star；当靶rna存在时，cas13a的crispr rna结合与之互补的靶rna，激活cas13a的侧链切割活性，以切割mb-rna-alp复合物并释放alp，在上清液中产生化学发光信号。化学发光信号的强弱，与h7n9病毒rna浓度成正相关。
17.步骤(2)中，使用premix taq进行pcr以扩增含有h7n9病毒的ha和na基因的质粒；使用pcr产物纯化试剂盒进行扩增双链dna产物纯化并通过onedrop定量；使用转录试剂盒将纯化的双链dna与t7聚合酶于37℃温育过夜；通过rna快速浓缩和纯化试剂盒纯化rna，并通过onedrop定量以制备梯度rna标准溶液；根据靶rna的序列设计crrna；将crrna对应的互补dna单链(包含t7启动子序列，终浓度10μm)进行退火，形成杂交双链。
18.步骤(3)中，5
’‑
末端氨基修饰和3
’‑
末端生物素修饰的rna探针通过缩合化学反应在羧基官能化的mb(mbs-cooh)上进行标记，并与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素alp-sa偶联形成mb-rna-alp复合体。
19.步骤(4)中，逆转录-重组酶介导的等温扩增(reverse transcription-recombinase aides amplification,rt-raa)扩增靶rna，用t7rna聚合酶转录出靶rna；当靶rna存在时，cas13a的crispr rna结合与之互补的靶rna，激活cas13a的侧链切割活性，切割mb-rna-alp复合物，并释放alp，检测h7n9病毒。
20.有益效果：
21.本发明将crispr-cas13a系统与cl和mbs三者联用，用于检测甲型h7n9禽流感病毒，是一项方法的创新。本发明利用rt-raa-cas13a-mb-cl放大碱性磷酸酶的化学发光信号检测核酸，克服了crispr结合中荧光检测背景高的问题；可以制备出mb-rna-alp复合物提前存储，整个检测过程可缩短至30min；被证明适用于流感病毒rna检测；尽管具有不兼容的反应系统，仍可进行复杂的生物样品的检测。在病毒检测和诊断方面有很大的应用前景，可以适应临床大规模筛选。因此，本发明检测方法有望扩大临床应用，实现临床应用自动化检测。
附图说明
22.图1为用于核酸检测的rt-taa-cas13a-mb-cl平台示意图；
23.图2为lwcas13a蛋白的表达和纯化；图2a为lwcas13a蛋白的表达；图2b为lwcas13a蛋白的纯化。
24.图3为rt-raa-cas13a-mb-cl检测各浓度h7n9病毒ha rna的化学发光强度拟合曲线。
25.图4为h7n9病毒特异性验证结果。
具体实施方式
26.下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
27.实施例1iptg诱导lwcas13a蛋白的表达和纯化
28.(1)使用plasmid mini kit(omega)试剂盒，根据试剂盒说明书内容，提取pc013pet his6-twinstrep-sumo-lwcas13a细菌(购自张锋实验室)的质粒，并使用one drop(美国热电公司)定量。
29.(2)取100μl冷冻保存的大肠杆菌感受态细胞lb21(cwbiotech)，加入50ng pc013pet his6-twinstrep-sumo-lwcas13a细菌的质粒轻轻混匀后(体积不超过10μl)，冰上静置30min后，42℃孵育90s，迅速冰上冷却5min；
30.(3)向上步的培养管中加入100μl lb液体培养基(按每升去离子水中加入10gnacl、10g蛋白胨、5g酵母粉的比例进行液体培养基的配制，并经121℃高压蒸汽灭菌20min。取配好的液体培养基按照1.2％的比例，加入琼脂粉配制lb固体培养基，高压蒸汽灭菌后，待lb固体培养基冷却至50℃左右时，加入氨苄(amp)至终浓度为100μg/ml，混匀后铺平板。无抗生素)，总体积200μl，37℃孵育45min；
31.(4)取100μl转化后的感受态细胞，均匀涂布于含氨苄(100μg/ml)的lb平板上，37℃温育过夜；
32.(5)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml含氨苄的3ml lb液体培养基的试管中，37℃220r/min振摇过夜；
33.(6)次日按体积比1:50接种于50μg/ml含氨苄的lb液体培养基中，37℃220r/min振摇至菌体od 600为0.6-0.8；
34.(7)取出1ml上步培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1
×
上样缓冲液(20mm na3po4，0.5m nacl，30mm异咪唑，ph7.4)重悬菌体沉淀；
35.(8)向剩余的培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg，sigma公司)至终浓度为0.5mm，16℃220r/min振摇过夜，诱导lwcas13a蛋白表达；
36.(9)继续16℃培养16小时后，取出1ml上步培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1
×
上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/min，离心10min，弃上清，用pbs(上海生工)重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入1
×
上样缓冲液重悬。
37.(10)进行12％ sds-page检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
38.(11)5000
×
g离心10min后，取细胞沉淀并重悬于溶菌buffer(20mm tris-hcl，500mm nacl，1mm dtt，ph 7.4)中，加入蛋白酶抑制剂(mce)和溶菌酶(thermofisher)；
39.(12)超声破碎：细胞破碎仪(上海净信公司)设置程序功率200w功率，超声2.5s，间
隔10s，超声破碎30min。
40.(13)4℃下以10,000g离心60min后，将上清液用220nm滤器过滤。
41.(14)取上清用镍柱(ge公司)纯化，镍离子亲和柱连接蠕动泵(longer pump)，超纯水清洗镍柱后，用结合缓冲液(20mm na3po4，0.5m nacl，30mm异咪唑，ph7.4)平衡镍柱，上清液过柱，再用结合缓冲液洗涤蛋白质结合柱(ge公司)三次，以洗掉杂蛋白。
42.(15)根据lwcas13a蛋白的结构特点，用250u约5ml的sumo蛋白酶溶菌缓冲液(20mm tris-hcl，500mm nacl，1mm dtt，ph 7.4)上柱，4℃旋转孵育过夜，用sumo酶(thermofisher)纯化lwcas13a蛋白。
43.(16)用溶菌buffer冲液洗涤柱子，用sds-page分析收集的溶液。
44.(17)将所有含lwcas13a的溶液用10000d超滤管去异咪唑后于储存缓冲液(600mm nacl，50mm tris-hcl，ph7.5，5％甘油，2mm dtt)中，-80℃冷冻存储。
45.图2为lwcas13a蛋白的表达和纯化。图2a为lwcas13a蛋白的表达。m，marker；泳道1，大肠杆菌未被iptg诱导；泳道2，iptg诱导大肠杆菌过夜；泳道3，沉淀破碎细胞；泳道4，破碎细胞的上清液。图2b为lwcas13a蛋白的纯化。m，marker；泳道1，破碎细胞的上清液；泳道2，用sumo酶处理；泳道3，洗脱液。从图中可以看出：含有sumo位点和标记蛋白的lwcas13a的分子量为155.2kd，但用sumo酶消化后为138.5kd。通过sds-page分析大肠杆菌中表达的lwcas13a，考马斯蓝染色凝胶结果显示，iptg显著诱导大肠杆菌中cas13a蛋白的产生(图2a，泳道2)。收集iptg诱导后的细菌溶液，离心，通过超声破碎细胞沉淀并再次离心。对破碎的细胞上清液和细胞沉淀进行sds-page分析。发现lwcas13a主要存在于上清液中(图2a，泳道3和4)。由于lwcas13a蛋白含有一个his-tag，本发明使用镍离子亲和层析来吸附水溶性蛋白。使用洗涤缓冲液从柱中洗脱出不含多个连续组氨酸的蛋白质，同时lwcas 13a仍在柱上，然后用sumo酶消化lwcas 13a中的sumo位点，lwcas 13a损失6
×
his，用裂解缓冲液很容易从柱中洗脱出来，用黑色箭头标出(图2b，泳道3)。通过这种纯化方法，可以获得高纯度的lwcas13a蛋白。
46.实施例2rna标准品和crrna的制备
47.(1)使用premix taq试剂盒(takara公司)，根据试剂盒说明书内容进行pcr，以扩增含有h7n9病毒的ha和na基因的质粒，h7n9质粒pcr扩增体系见表1：
48.ha-f：cctggtattcgctctgattgc；
49.ha-r：taatacgactcactatagggaggcaccgcatgtttccattct。
50.na-f：gaaacaaccaacacaagcca；
51.na-r：taatacgactcactatagggcatccgagctttctccaattctt。
52.上述引物购自生工生物。
53.表1h7n9质粒扩增体系
[0054][0055]
(2)使用pcr产物纯化试剂盒(上海生工)，根据试剂盒说明书内容，进行扩增双链dna产物的纯化，并通过one drop定量，获得双链dna产物。
[0056]
(3)使用转录试剂盒(neb)将纯化的双链dna与t7聚合酶(neb)于37℃孵育过夜。通过rna快速浓缩和纯化试剂盒(上海生工)纯化rna，并通过one drop定量，以制备梯度rna标准溶液(10fm,100fm,1pm,10pm,100pm,1nm，10nm)。
[0057]
(4)根据靶rna的序列设计crrna。将crrna对应的互补dna单链(包含t7启动子序列，终浓度10μm)进行退火(pcr 95℃变性2min。缓慢降至25℃，降温过程至少用时45min，短期保存于4℃，长期保存于-20℃)，形成杂交双链。
[0058]
ha-crrna-dnaf：
[0059]
taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggact aaaacgattgacccagtcaaactaagcagcggc；
[0060]
ha-crrna-dnar:
[0061]
taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggact aaaacgattgacccagtcaaactaagcagcggc；
[0062]
ha-crrna:
[0063]
rgrgrgrgrarurururargrarcrurarcrcrcrcrarararararcrgrarargrgrgrgrarcru rararararcrgrarururgrarcrcrcrargrurcrarararcrurarargrcrargrcrgrgrc；
[0064]
na-crrna-dnaf
[0065]
taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaactcca aatagaagaaagaacaagcaggaa；
[0066]
na-crrna-dnar
[0067]
ttcctgcttgttctttcttctatttggagttttagtccccttcgtttttggggtagtctaaat cccctatagtgagtcgtatta；
[0068]
na-crrna
[0069]
grgrgrgrarurururargrarcrurarcrcrcrcrarararararcrgrarargrgrgrgrarcrurararararcr urcrcrarararurargrarargrararargrararcrarargrcrargrgrara。
[0070]
实施例3mb-rna-ap复合物的制备
[0071]
取4℃冰箱保存的10mg/ml的羧基化mbs(life technologies)，在涡旋振荡器上涡旋5min混匀mbs，将100μl混匀后mbs转移到新的离心(ep)管中，用1ml 100mm mes缓冲液(大连美仑生物技术有限公司)洗涤mbs两次，并重悬于800μl相同的mes缓冲液中，接着加入1.25m的edc和rna探针补充至总体积1ml，涡旋混匀10s。旋转混合4℃孵育过夜。第二天用1ml tt缓冲液(取12.114g tris溶于90ml ddh2o中，然后加100μl 10％ tween-20，定容至100ml，调ph为8.0。每轮孵育30min)封闭mbs 2次后，用1ml nab缓冲液(取12.114g tris溶于90ml ddh2o中，然后加100μl 10％ tween-20，定容至100ml，调ph为8.0)重悬mbs，加入alp(大连美仑生物技术有限公司，按照体积比alp:mbs＝1：10)后旋转混合1小时。用1ml tt缓冲液洗涤mbs 2次，4℃下储存于tt缓冲液。
[0072]
rna探针序列：
[0073]
/5’aminoc6/rurcrgrgrurururgrurarargrcrcrargrurururururcrgrurcrararurc rargrurururururcrurararurcrgrgrcrcrargru/3’biotin。
[0074]
实施例4用crispr-cas13a mbs系统检测ha或na基因的rna
[0075]
使用rt-raa核酸扩增试剂盒(qitian gene biotechnology)和hiscribe t7快速高产rna合成试剂盒(neb)进行改进的检测分析，如下所示：
[0076]
0.48μm正向引物(cctggtattcgctctgattgc)、0.48μm反向引物(taatacgactcactatagggaggcaccgcatgtttccattct)、14mm无水乙酸镁(大连美仑生物技术有限公司)、12.5μl mm rntp(neb)、2.5μm lt7 mix(neb)、各种浓度的目标rna、2μl鼠rna酶抑制剂(neb)和25μl酶混合液(qitian gene biotechnology)至50μl最终体积。
[0077]
每次反应按2μl初始mbs(life technologies)量加入反应溶液(11.25nm纯化的lwcas13a，22.5nm crrna，1μl rnase抑制剂(neb)，100ng背景rna(从人外周血单个核细胞纯化))和各浓度梯度的靶rna(10fm,100fm,1pm,10pm,100pm,1nm，10nm)与mbs复合物(mb-rna-ap)混合，用nab缓冲液补足50μl，用于ha rna和na rna检测。
[0078]
通过磁分离器(thermofisher公司)分离上述溶液，加入alp底物cdp-star(希森美康公司)。当靶rna存在时，cas13a的crispr rna结合与之互补的靶rna，激活cas13a的侧链切割活性，切割mb-rna-alp复合物，并释放alp，在上清液中产生化学发光信号。
[0079]
图3为rt-raa-cas13a-mb-cl检测h7n9病毒ha rna的各个浓度的化学发光强度，拟合的曲线(简单线性回归)线性范围为100fm-1nm，最低检测限为19.7fm。
[0080]
图4为h7n9病毒特异性验证结果。h7n9病毒样本和其他病毒样本，包括季节性流感病毒(a/h1n1和a/h3n2)、2009年猪源性流感病毒a/h1n1和禽流感病毒(a/h5n1和a/h9n1)，均可以使用rt-raa-cas13a-mb-cl法检测。
[0081]
本发明利用rt-raa-cas13a-mb-cl，克服了crispr结合中荧光检测背景高的问题；可以制备mb-rna-alp复合物提前存储，整个检测过程可缩短至30min；被证明适用于流感病毒rna检测；尽管具有不兼容的反应系统，仍可进行复杂的生物样品的检测，最低检测限19.7fm。在病毒检测和诊断方面有很大的应用前景，可以适应临床大规模筛选。因此，本发明检测方法有望扩大临床应用，实现临床应用自动化检测。
[0082]
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。