同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针、试剂盒的制作方法

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针、试剂盒。

背景技术：

1、逆转录病毒(endogenoμs retrovirμs)是一种包膜rna病毒，编码逆转录酶，将单链rna基因组转录成双链dna，整合酶将此dna整合到被感染细胞的基因组中。猪内源性逆转录病毒(porcine endogenoμs retrovirμs，perv)是一种γ-逆转录病毒，分为三种亚型，即perv-a、-b、-c。perv-a和perv-b存在于所有猪的基因组中，而perv-c只存在于部分猪中。

2、猪作为异种移植的供体的研究已经被证明是克服同种异体器官移植短缺问题的重要途经，并且已经证明大多数已知的微生物通过选择、疫苗接种、抗病毒药物、早期断奶、初乳剥夺和胚胎移植来消除，但猪内源性逆转录病毒(pervs)消整合在猪的基因组中，难以被消除，成为猪作为异种移植供体的一大难点。

3、perv在原始感染猪生殖细胞，因此所有的猪细胞在其基因组中都含有perv前病毒，整合到猪的基因组中，因其产生感染人类细胞的病毒颗粒，因此对异种移植构成特殊风险。perv-a和perv-b为多噬性，能够在体外复制感染人类细胞，而perv-c为亲噬性，仅能在猪细胞体系中进行复制，故不能感染人类细胞。而perv-a/c是一种重组perv-c，能够感染人类细胞，并且具有较高复制率。并且研究表明perv-a/c在人类细胞中复制迅速并且在患病的猪中perv-a/c病毒血症的发病率显著增加。由于perv-a和perv-c之间的重组位点不是固定的而且这些病毒基因组序列高度相同，存在假阳性和假阴性的担忧。目前还未有用于检测perv-a/c重组体的可靠引物。因此，本发明基于荧光定量pcr技术，基于不同荧光信号探针，使用了一组荧光定量pcr引物和探针池，

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针、试剂盒，能够同时检测perv-a，perv-b，perv-c和perv-a/c重组病毒，并进行病毒拷贝数定量，为猪作为异种移植供体提供支持。

2、为此，本发明提供了如下的技术方案：

3、一种同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针，所述引物包括：上游引物perv-f，其包含如seq id no.1所示的核苷酸序列；下游引物perv-r，其包含如seq id no.2所示的核苷酸序列；

4、所述荧光探针包括：

5、荧光探针perv–ap，其包含如seq id no:3所示的核苷酸序列；

6、荧光探针perv–bp，其包含如seq id no:4所示的核苷酸序列；

7、荧光探针perv–cp，其包含如seq id no:5所示的核苷酸序列；

8、荧光探针perv–a/cp，其包含如seq id no:6所示的核苷酸序列。

9、可选的，所述荧光探针一端含有荧光报告基团，另一端含有荧光淬灭基团；

10、可选的，所述荧光探针的5’端连接有荧光报告基团6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、vic荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-x-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5，所述荧光探针的3’端连接有荧光淬灭基团mgb。

11、可选的，所述荧光探针的5’端连接的荧光报告基团不同。

12、一种同时检测4种猪内源性逆转录病毒的试剂盒，包括所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针。

13、可选的，还包括pcr预混液、阴性质控品、perv-a标准品、perv-b标准品、perv-c标准品和perv-a/c标准品；

14、可选的，所述阴性质控品为无菌水；

15、可选的，所述perv-a标准品、perv-b标准品、perv-c标准品和perv-a/c标准品为含有目的片段的纯化质粒，分别稀释成5×101～5×108copies/μl，共8个浓度梯度；

16、可选的，所述perv-a标准品中含有的perv-a目的片段如seq idno.7所示；

17、可选的，所述perv-b标准品中含有的perv-b目的片段如seq idno.8所示；

18、可选的，所述perv-c标准品中含有的perv-c目的片段如seq idno.9所示；

19、可选的，所述perv-a/c标准品中含有的perv-a/c目的片段如seq idno.10所示。

20、可选的，还包括pcr扩增体系：

21、pcr master mix，12.5μl；

22、上游引物perv–f，10μm，0.7-1μl；

23、下游引物perv–r，10μm，0.7-1μl；

24、荧光探针perv–ap，浓度为10μm，0.15-0.25μl；

25、荧光探针perv–bp，浓度为10μm，0.15-0.25μl；

26、荧光探针perv–cp，浓度为10μm，0.15-0.25μl；

27、荧光探针perv–a/cp，浓度为10μm，0.15-0.25μl；

28、dna模板，1μl；

29、无菌水补足至25μl。

30、可选的，还包括pcr扩增体系：

31、pcr master mix，12.5μl；

32、上游引物perv–f，10μm，1μl；

33、下游引物perv–r，10μm，1μl；

34、荧光探针perv–ap，浓度为10μm，0.25μl；

35、荧光探针perv–bp，浓度为10μm，0.25μl；

36、荧光探针perv–cp，浓度为10μm，0.25μl；

37、荧光探针perv–a/cp，浓度为10μm，0.25μl；

38、dna模板，1μl；

39、无菌水补足至25μl。

40、所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针或所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的试剂盒在同时检测4种猪内源性逆转录病毒中的用途。

41、一种同时检测4种猪内源性逆转录病毒的方法，包括利用所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针或所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的试剂盒对待测样品进行荧光定量pcr检测。

42、可选的，包括如下步骤：

43、(1)、提取待测样品的总rna，然后逆转录反应，得到的cdna；

44、(2)、将得到的cdna作为模板，利用权利要求1或2所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针或权利要求3-6任一项所述的同时检测4种猪内源性逆转录病毒的试剂盒进行荧光定量pcr反应，并同时进行阴性质控品和标准品的荧光定量pcr反应，制作标准品的标准曲线；

45、(3)将待测样品测得的ct值和标准曲线计算待测样品中4种猪内源性逆转录病毒的浓度。

46、可选的，所述荧光定量pcr反应中，pcr扩增反应的条件为：95℃，保持5min；95℃保持10s，60℃保持40s，40个循环。

47、本发明技术方案，具有如下优点：

48、1.本发明提供的一种同时检测4种猪内源性逆转录病毒的引物和探针，本发明基于perv-a，perv-b，perv-c和perv-a/c基因组上的保守区，设计高特异性引物和探针，可在一次反应中对perv-a，perv-b，perv-c和perv-a/c进行有效检测并定量，降低了反应成本，提高了检测通量。本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到500copies/μl，且特异性高，不与其他病毒产生交叉反应。检测速度快，从样本采集到得出结果，可在3个小时内完成。