一种提高HCP检测抗体覆盖率的抗体组合及其应用的制作方法

本发明属于检测领域，具体涉及一种提高hcp检测抗体覆盖率的方法。

背景技术：

1、在传统化学药物开发难度及成本越来越大的形势下，目前，由于生物技术类药物的诸多优势，其在全球范围内已得到迅猛的发展。生物技术类药物种类较多，包括重组蛋白类药物，例如单抗，重组蛋白疫苗等；细胞及基因治疗药物(cell and gene therapy，cgt)，例如car-t，溶瘤病毒等；mrna治疗技术，例如mrna疫苗等。这些生物技术类药物的生产工艺比较复杂，会引入较多的杂质，对药物的质量产生潜在的负面影响，因此监管层对生物技术类药物的质量控制也提出了更高的要求。

2、目前生物技术类药物始终需要通过工程类细胞，如细菌、酵母或哺乳动物、昆虫或植物细胞系等，来进行原料的生产。经典的重组蛋白表达技术已在许多生物制药产品中得到广泛的应用，主要采用宿主细胞进行外源蛋白质的表达和修饰。cgt药物生产关键物料，如质粒，也是在大肠杆菌中扩增纯化获取。基因治疗的假病毒载体需要在hek293等细胞内重新合成组装。在这类产品的生产过程中，宿主细胞来源的蛋白质(host cell proteins，hcp)会不可避免地被引入到生产工艺流程中，从而产生最终药品中hcp的残留风险。科学研究已发现生物制药产品中残留hcp的主要危害是其有诱导机体产生抗hcp抗体的可能性，这些抗体可能会引起患者产生临床症状。此外，hcp可能作为免疫佐剂，诱导产生抗药抗体，影响药物安全性或有效性，因此全球各个国家的监管机构对hcp残留都有严格的限量要求。

3、目前，hcp的分析检测方法较多，其中hcp elisa方法由于其操作方便快捷，成本较低，检测通量较高等优点，已被监管机构和企业广泛运用于纯化工艺开发和原液的放行检中。hcp elisa检测方法原理是采用多克隆抗体的双抗体夹心法，其中关键点之一是采用的多克隆抗体能识别尽可能多的hcp，即高覆盖率，否则会导致漏检的风险。高覆盖率的hcp抗体是hcp elisa检测方法验证的关键参数之一。由于hcp是多种蛋白质的复合物，分子量从5kda到250kda，等电点在3-11区间，常规方法制备的抗体覆盖率往往不够理想，并且直接导致实际样本的检测适用性低，漏检的风险高。

技术实现思路

1、为了克服上述样本检测适用性低、覆盖率低，且检测灵敏度、检测效率不高的缺陷，本发明提供一种提高hcp检测抗体覆盖率的方法。

2、本方法是针对hcp抗原，其含有上千种以上的蛋白分子，如何使获得的多克隆抗体尽可能多地识别这些hcp抗原是目前需要解决的关键问题。从动物产生抗体的免疫学原理来理解，需要合适的抗原量，免疫周期和途径等方面进行优化。并且抗原本身分子量大小也会影响抗体的产生。因此，用总的hcp抗原免疫会导致对某些hcp抗原的免疫反应较弱，无法获得抗体。

3、本发明通过将低分子量分离，提升对低分子量hcp抗原的免疫反应。通过将hcp抗原中高丰度或高分子的容易产生抗体和hcp抗原分离，加强对免疫原性低的抗原的免疫反应。

4、为了解决现有技术的缺陷，本发明第一方面提供一种抗hcp抗体组合，使用抗原分别免疫动物后制备得到各抗体的组合；所述抗原包括低免疫原性hcp，优选还包括以下抗原中的一种或多种：宿主细胞总hcp(host cell proteins)、低分子量hcp和高分子量hcp所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；优选所述真核细胞为cho细胞，所述原核细胞为大肠杆菌，所述大肠杆菌例如为escherichia coli。

5、在某些实施例中，所述低免疫原性hcp为所述宿主细胞总hcp经纯化得到的产物，和/或，所述低分子量hcp为分子量小于55kda例如小于50kda的hcp，例如分子量为：10kda≤分子量<55kda，和/或，所述高分子量hcp为分子量高于55kda例如高于60kda的hcp，例如分子量为：55kda≤分子量≤250kda；和/或，所述动物为哺乳动物优选羊例如绵羊。

6、在某些实施例中，所述抗原包括宿主细胞总hcp、低分子量hcp和低免疫原性hcp，或宿主细胞总hcp、低分子量hcp、高分子量hcp和低免疫原性hcp；由此得到的抗hcp抗体组合包括抗低免疫原性hcp抗体、抗总hcp抗体和抗低分子量hcp抗体，或抗低免疫原性hcp抗体、抗总hcp抗体、抗低分子量hcp抗体和抗高分子量hcp抗体。

7、在某些实施例中，获得所述宿主细胞总hcp的步骤包括：

8、(1)将宿主细胞例如e.coli bl21的菌溶液与裂解溶液混合例如以1:10的比例混合，混匀，获得混合菌液；所述菌溶液例如利用宿主细胞菌体与水混合而成；

9、(2)将所述混合菌液破碎后获得破碎菌液；

10、(3)将所述破碎菌液离心后获得的上清液即为宿主细胞总hcp；或，

11、所述宿主细胞总hcp通过以下步骤获得：将所述宿主细胞进行浓缩例如使用peg20000进行浓缩，即得。

12、优选地，步骤(1)中，所述裂解溶液是由0.2m nahco3溶液和蛋白酶抑制剂混合而得，ph为8.0-9.0例如为8.3；

13、步骤(2)中，所述破碎的压力为1000-1500bar例如1200bar，和/或，所述破碎的温度为10℃；所述破碎使用可细胞破碎仪等本领域常用的破碎仪器。

14、步骤(3)中，所述离心的速度为10000-15000g例如12000g，和/或，所述离心的温度为4℃。

15、在某些实施例中，所述低分子量hcp的制备方法为将所述宿主细胞总hcp经分子筛层析获得洗脱液，所述洗脱液即为所述低分子量hcp。

16、优选地，所述分子筛层析的步骤包括：进行平衡、进样、洗脱和收集洗脱液。

17、更优选地，所述平衡和洗脱使用的溶液为0.2m nahco3溶液，和/或，

18、所述分子筛层析使用hiload 16/600superdex 200pg层析柱；和/或，

19、所述洗脱液还进行了浓缩。

20、在某些实施例中，所述低免疫原性hcp由所述宿主细胞总hcp经fplc纯化获得。

21、优选地，所述fplc的步骤包括：

22、所述宿主细胞总hcp经过滤例如0.22μm滤膜过滤后上样，洗脱并收集洗脱液，即得所述低免疫原性hcp。

23、更优选地，所述fplc的流动相为：流动相a：pbs，ph 7.4，收集流穿液；

24、切换流动相b：0.075％ pbst，ph 7.4；

25、切换流动相c：0.1m gly-hcl，ph 2.5。

26、在某些实施例中，所述fplc使用偶联抗体纯化柱，制备所述偶联抗体纯化柱的步骤包括：

27、(a)用酸例如0.1m hcl清洗nhs活化胶；

28、(b)将所述抗总hcp抗体与所述nhs活化胶混匀，离心去除上清液；所述混匀例如为室温下旋转2h；

29、(c)加入0.1-0.5m tris-hcl例如0.1m tris-hcl，ph8.0，混匀并孵育，使所述抗总hcp抗体与所述nhs活化胶发生偶联；所述混匀例如在室温下旋转2h，所述孵育例如在2-8℃培养15-20h；

30、(d)用缓冲液例如pbs清洗，将偶联合格例如偶联率>90％的填料进行装柱。

31、优选地，所述的抗hcp抗体组合由抗总hcp抗体、抗低分子量hcp抗体和抗低免疫原性hcp抗体组成，优选其比例为(1～2):(1～2):1，例如为1:1:1。

32、本发明第二方面提供一种试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的抗hcp抗体组合。优选地，还包括免疫相关的检测试剂，如缓冲液，例如pbs缓冲液。

33、上述免疫相关的检测试剂包括本领域技术人员常规所用的试剂。

34、本发明第三方面提供一种检测hcp的方法，所述方法包括：

35、将如本发明第一方面所述的抗hcp抗体组合或如本发明第二方面所述的试剂盒的抗hcp抗体组合中的各抗体按比例混合后进行检测。优选地，抗总hcp抗体、抗低分子量hcp抗体和抗低免疫原性hcp抗体的比例为(1～2):(1～2):1；更优选地为1:1:1。

36、适用于本发明的覆盖率的检测方法可为若干种，除了imbs-2d，还可为2d-wb、iac-2d、质谱等本领域常规检测覆盖率的方法。

37、本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的抗hcp抗体组合或本发明第二方面所述的试剂盒在检测hcp或者制备检测hcp的诊断剂中的应用。

38、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

39、本发明所用试剂和原料均市售可得。

40、本发明的积极进步效果在于：本发明通过分级hcp免疫的方法进行抗体的制备，包括总hcp蛋白，低分子量hcp蛋白(low molecular weight，lmw)，低免疫原性hcp蛋白，这3种抗原进行动物免疫，获得高效价的抗体。然后，通过抗体配比组合优化，使得检测方法获得较高的检测灵敏度，同时满足高覆盖率要求。