一种D-氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于生物，尤其涉及一种氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、草铵膦铵盐(简称ppt)是1986年由德国赫斯特公司开发的一种非选择性除草剂，其化学名为2-氨基-4-(羟甲基膦基)丁酸，是一种亲水性的氨基酸类除草剂，具有活性高、有效用量少、杀草迅速、作用杂草种类多、在土壤中易降解、对于周边环境的压力小等优点。是目前用量仅次于草甘膦的世界第二大转基因作物耐受除草剂，其市场需求量随着转基因作物的快速发展而大大增加。草铵膦分子内有一个手性碳原子(c2)，其具有两种不同的构型，其中只有l-草铵膦具有除草活性，且在土壤中易分解，对环境的压力较小。商业化应用的草铵膦除草剂通常由d，l-草铵膦的外消旋混合物组成，其中含有50％的d-草铵膦无除草活性，因此通过将d-草铵膦转化为l-草铵膦，能够减少草铵膦除草剂一半的用量，这对于降低应用成本，提高原子经济性以及减轻环境压力具有重要意义。

2、目前的l-草铵膦主流制备方法包括化学法和生物催化法。由于化学法存在步骤繁琐、成本偏高、产品光学纯度偏低以及用到大量有机试剂或剧毒试剂，安全性较差且环境不友好等缺点。目前精草铵膦生产厂家基本都采用生物法生产。生物催化法生产草铵膦具有反应条件温和、立体选择性高、收率高等优点，是工业化制备l-草铵膦的重要趋势。主要包括酶法合成法和酶法拆分法两类：

3、(1)酶法合成法主要以以l-草铵膦的衍生物(如n-苯乙酰-d,l-草铵膦或草铵膦腈胺)为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。

4、(2)酶法拆分法利用外消旋的d,l-草铵膦为底物，通过两步酶法进行选择性拆分，将d型草铵膦通过d-氨基酸氧化酶(daao)转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)，并进一步还原为l-草铵膦，同时保留原有质量分数为50％的l-草铵膦。该法具有原料简单易得，成本较低，工艺简单以及绿色环保等优势，具有较高的工业化应用价值。但由于d-草铵膦属于非天然底物，野生型d-氨基酸氧化酶无法识别，导致催化效率低下，限制了其工业应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种d-氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用。

2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

3、一种d-氨基酸氧化酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:3所示。

4、在同一个技术构思下，本发明还提供一种d-氨基酸氧化酶突变体的表达载体包含编码所述d-氨基酸氧化酶突变体的核苷酸。

5、在同一个技术构思下，本发明还提供一种d-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌由所述表达载体通过常规转化或转染技术引入宿主细胞后获得。

6、优选的，所述宿主细胞为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或大肠杆菌(escherichiacoli)中的至少一种。

7、在同一个技术构思下，本发明还提供一种所述d-氨基酸氧化酶突变体基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

8、(1)参照seq id no.1所示的d-氨基酸氧化酶氨基酸序列，确定d-氨基酸氧化酶突变位点为如seq id no:3所示的d-氨基酸氧化酶序列的第54位的氨基酸残基的替换为n54t，第213位的氨基酸残基的替换为m213t，第223位的氨基酸残基的替换为y223f，第335位的氨基酸残基的替换为s335q，第341位的氨基酸残基的替换为s341g，设计突变引物，进行突变pcr；(2)将pcr得到的产物中进行酶切处理，结束后将产物转化至感受态细胞，培养并提取重组表达载体；所述表达载体可以是可方便地进行重组dna程序并且可引起d-氨基酸氧化酶突变体的多核苷酸表达的任何载体(例如质粒或病毒)。优选的，步骤(2)所述的表达载体可以采用pet28、pet29、pet30系列载体中的其中一种。(3)将重组表达载体转入表达到宿主细胞中，获得d-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。

9、在一些实施方式中，所述重组宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞属于酵母属(saccharomyces)、曲霉属(aspergillus)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、放线菌属(actinomycetes)、链霉菌属(streptomyces)、芽孢杆菌属(bacillus)或埃希氏杆菌属(escherichia)；优选地属于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)、链霉菌(streptomyces)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或大肠杆菌(escherichiacoli)中的至少一种。

10、优选的，步骤(1)所述pcr扩增采用以下定点突变引物：

11、1)n54t-f的引物序列：5’-gggccggtgcaacctggacccctcagatgaccctgacc-3’；

12、2)n54t-r的引物序列：5’-ggggtccaggttgcaccggcccacggacttgcaaaagtc-3’；

13、3)m213t-f的引物序列：5’-cgttgtacaaccgatagcagcgatccagcaagcccg-3’；

14、4)m213t-r的引物序列：5’-gctgctatcggttgtacaacgtttacacgggcttttaac-3’；

15、5)s335q-f的引物序列：5’-ggttttagccaggccggttatcagcagtcatggggtgca-3’；

16、6)s335q-r的引物序列：5’-gataaccggcctggctaaaaccgtatgcatgaac-3’。

17、7)y223f-f的引物序列：5’-caagcccggcatttattattcctcgtccgggtggtgaag-3’；

18、8)y223f-r的引物序列：5’-gaggaataataaatgccgggcttgctggatcgctgctatc-3’；

19、9)s341g-f的引物序列：5’-gttatcagcagggttggggtgcagcagaagatgttg-3’；

20、10)s341g-r的引物序列：5’-ggttttagccaggccggttatcagcagtcatggggtgc-3’。

21、可以通过常规转化或转染技术将本技术的表达载体引入原核或真核细胞中。在本文中使用时，术语“转化”和“转染”是指在用于将外来核酸(例如dna)引入本领域技术人员公知的宿主细胞中的多种本领域公认的技术。

22、本技术所述的“d-氨基酸氧化酶突变体”具有d-氨基酸氧化酶活性，即将d-氨基酸转化成酮酸(酮酸种类由d-氨基酸底物决定)、氨和过氧化氢的活性，特别地，本技术所述的d-氨基酸氧化酶突变体具有将d-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)的活性。

23、在同一个技术构思下，本发明还提供一种d-氨基酸氧化酶突变体在酶法拆分外消旋d,l-草铵膦中的应用。

24、优选的，所述d-氨基酸氧化酶突变体生产l-草铵膦将d-草铵膦转化为生产l-草铵膦的关键中间体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，同时保留原有外消旋d,l-草铵膦中质量分数占比为40-60％的l-草铵膦。

25、在一些实施方式中，所述d-草胺膦最初存在于d-和l-草胺膦或其盐的外消旋混合物中。外消旋的草胺膦起始原料可以以多种形式提供。可使用外消旋草胺膦的各种盐，诸如铵盐和盐酸盐，或两性离子。

26、优选的，具体包括以下步骤：

27、在多酶催化体系下通过使用d-氨基酸氧化酶使外消旋d，l-草铵膦中的d-草铵膦发生氧化转化反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，拆分后保留的l-草铵膦在底物d,l-草铵膦中的质量分数占比为40-60％；并使用过氧化氢酶使副产物过氧化氢分解为水和氧气。

28、在一些实施方式中，所述酶催化体系中还包括过氧化氢酶。所述过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢以防止过氧化氢的积累对酶催化剂造成的毒害作用。过氧化氢酶可以为本领域已知的任何具有过氧化氢酶活性的酶，例如购自上海源叶生物科技有限公司，商品编号为cas9001-05-2的过氧化氢酶。

29、优选的，所述多酶催化体系包括：用于将d-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的d-氨基酸氧化酶突变体，用于将副产物过氧化氢转化为水和氧气的过氧化氢酶。

30、优选的，所述酶催化体系中的每种酶的形式各自独立地选自：游离酶和/或引入酶的表达载体的宿主细胞。

31、优选的，其中，以湿菌体重量计，所述引入酶的表达载体的宿主细胞的总添加量为1-200g/l反应液。

32、优选的，所述酶催化转化反应在ph为7-10的反应液体系中进行，优选地，所述反应体系的ph为8-9。

33、优选的，所述d-氨基酸氧化酶突变体催化的d，l-ppt的氧化反应的反应温度为25-45℃，时间为6-24h。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

35、(1)本技术所述d-氨基酸氧化酶突变体具有更高的催化效率，具有对d-草铵膦较高的催化活性，能够应用于生物酶法去消旋化制备l-草铵膦。当使用外消旋型d,l-草铵膦为底物进行催化转化反应时，转化率远高于野生型，ppo产率也大幅提升，同时保留了底物中原有的l-草铵膦，提高了底物利用率，大幅降低成本。

36、本技术中所用的术语“催化效率”是指d-氨基酸氧化酶允许其将d-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的性质。在一个实施方案中，与野生型或参照d-氨基酸氧化酶相比，本技术的d-氨基酸氧化酶突变体的催化效率得以增强。

37、在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶突变体的核苷酸序列与seq id no.6所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述d-氨基酸氧化酶突变体包含与野生型酶相比具有一个或几个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸替换、缺失和/或插入的氨基酸序列和/或与野生型酶相比具有一个或多个截短的氨基酸序列。

38、(2)在多酶催化体系去消旋拆分d，l-草铵膦，液相检测ppo的生成量，计算获得底物的转化率如图1所示。制备的ppo，底物转化率≥49.95％，反应步骤简单，反应条件温和，原料价格低廉，产物分离简便，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。

39、(3)本技术所述的方法用于在同一个反应容器中进行，同时产物的产率可以通过本领域已知的任何方法测量，如通过高效液相色谱(hplc)来测量所获得的产物中ppo的含量。