一种生物转化合成胞二磷胆碱的方法与流程

本发明属于生物转化合成，涉及胞二磷胆碱生物合成，具体涉及以胞苷酸和氯化磷酸胆碱为原料，采用固定化细胞及酶偶联生产胞二磷胆碱的方法。

背景技术：

1、胞嘧啶核苷二磷酸胆碱(简称胞二磷胆碱，cdp-胆碱或cdpc)，分子式c14h26n4o11p2，分子量488.33，是19世纪50年代由kennedy博士等人发现并确定其分子结构及生物学功能。胞二磷胆碱是生命体磷脂代谢的重要前体，是卵磷脂生物合成必须的辅酶。研究证明胞二磷胆碱能促进生物代谢，尤其是磷脂的生物合成，具有改善心血管功能，增强大脑血流量，复活中枢神经系统，改善意识状态，恢复损伤组织细胞膜的结构等功能。

2、胞二磷胆碱作为一种生化药物是上世纪由日本武田株式会社研发并于1963年应用于临床，用于治疗脑外伤、脑手术伴随的意识障碍。其商品名为nicholin，中文译名：尼柯灵。随着临床研究的进展，现胞二磷胆碱已作为脑外科、神经内科的常用药，用于治疗脑外伤、脑震荡后遗症及其所引发的意识障碍，神经官能症和脂肪肝等疾病，临床需求量很大。

3、目前胞二磷胆碱的合成方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法以5’-胞苷酸(5’-cmp)和氯化磷酸胆碱(cp)为底物，用对甲苯磺酰氯为缩合剂，在n-二甲基甲酰胺(dmf)的环境中化学合成胞二磷胆碱。1956年eugene pkennedy化学方法合成胞二磷胆碱；1971年kiyomi kikugawa化学合成提取出胞二磷胆碱。其缺点是难以与缩合剂分离，产品不适合药用；转化率低且污染大。

4、生物转化法又称酶促合成法，主要是利用酵母菌或基因工程菌催化合成胞二磷胆碱。eugene p kennedy等人利用大白鼠及豚鼠磷酸胆碱胞苷酸转移酶催化ctp和氯化磷酸胆碱合成胞二磷胆碱；1970年hakko kogaku zasshi利用废酵母催化合成胞二磷胆碱；顾复昌等利用啤酒酵母生物合成胞二磷胆碱；易凤炎等研究酿酒酵母生物合成胞二磷胆碱的条件优化；2013年刘桂祯等利用固定化大肠杆菌克隆表达胞苷磷酸转移酶，催化ctp和氯化磷酸胆碱合成胞二磷胆碱；2015年应汉杰等利用表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的基因工程菌催化合成胞二磷胆碱，游离细胞合成胞二磷胆碱不易分离且不利于重复使用。

技术实现思路

1、本发明提供一种以廉价的胞苷酸为起始原料制备胞二磷胆碱的方法。整个过程以胞苷酸、氯化磷酸胆碱为原料为原料，在固定化酵母细胞及固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶的共同作用下进行生物转化合成胞二磷胆碱(cdpc)。该工艺生产周期短、原料易得且成本低廉、易于产业化，极具市场竞争力。

2、本发明所述偶联合成胞二磷胆碱的方法，包括如下步骤：以胞苷酸、氯化磷酸胆碱为原料，在固定化酵母细胞及固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶共同作用下进行生物转化，得到胞二磷胆碱。

3、进一步地，在上述技术方案中，反应体系中加入葡萄糖、磷酸二氢钾、mg2+启动反应。

4、进一步地，在上述技术方案中，整个合成过程具体包括：细胞菌体活化、固定酵母细胞制备和固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶制备、偶联转化反应。

5、进一步地，在上述技术方案中，整个合成过程具体包括，细胞菌体活化、固定化酵母细胞制备和固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶制备、偶联转化反应。

6、进一步地，在上述技术方案中，所述细胞菌体活化为，将酵母菌株及大肠基因工程菌进行活化培养。

7、进一步地，在上述技术方案中，所述固定化酵母细胞制备为，将酵母菌体细胞与浓度为35-45g/l海藻酸钙溶液混合，滴入浓度为55-65g/l cacl2溶液中，制得直径为4-6mm酵母细胞固定化酵母细胞胶珠。

8、进一步地，在上述技术方案中，所述酵母菌体细胞制备为，配制好酵母发酵培养基后，加入发酵罐，进行连续流高密度发酵培养，待酵母菌菌体达到恒定浓度后，离心收获得到酵母菌体细胞。

9、进一步地，在上述技术方案中，所述酵母发酵培养基为葡萄糖20-30g/l，硫酸铵1-4g/l，磷酸二氢钾1-4g/l，七水硫酸镁1-4g/l，酵母膏20-30g/l，蛋白胨1-3g/l。

10、进一步地，在上述技术方案中，所述固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶制备为，将工程菌菌体细胞破碎，加入硫酸铵沉淀处理，磷酸胆碱胞苷酰转移酶与活化载体树脂交联制备成固定化酶树脂。

11、进一步地，在上述技术方案中，所述工程菌菌体细胞的制备为，配制好大肠杆菌工程菌发酵培养基后，加入发酵罐，发酵培养结束后，用iptg诱导培养，然后微滤或离心得磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因工程菌菌体细胞。

12、进一步地，在上述技术方案中，所述大肠杆菌工程菌发酵培养基为葡萄糖25-35g/l，七水硫酸镁0.2-0.4g/l，磷酸二氢钾2-4g/l，磷酸氢二钠4-6g/l，氯化铵0.5-1.5g/l，酵母膏15-25g/l，蛋白胨10-20g/l。

13、进一步地，在上述技术方案中，所述偶联转化反应体系为，氯化磷酸胆碱5-8g/l，硫酸镁2-4g/l，磷酸二氢钾40-60g/l，cmp 10-20g/l，葡萄糖50-70g/l，固定化酵母细胞45-55g/l，固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶10-20g/l。

14、本发明合成方法典型的操作过程为：以胞苷酸和氯化磷酸胆碱为起始原料，在转化体系中加入葡萄糖、磷酸二氢钾、mg2+，在固定化酵母细胞及固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶共同作用下，转化得到胞二磷胆碱。采用反应方程式表示为：

15、

16、本发明是一种以胞苷酸为底物，偶联合成胞二磷胆碱的方法，具体采用如下步骤：(1)将酵母菌株及大肠基因工程菌在合适条件下进行活化培养。(2)将酵母菌株进行连续流动高密度发酵培养，待菌体达到恒定浓度后，离心收获得到菌体细胞。(3)将浓度为35-45g/l海藻酸钙溶液与活化后酵母细胞混合，通过蠕动泵滴入浓度为55-65g/l cacl2溶液中，搅拌，固化20min，制得直径为4-6mm酵母细胞固定化胶珠。(4)将大肠工程菌进行发酵培养并用iptg(0.1-0.2g/l)诱导，离心收集磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因工程菌菌体细胞。(5)把得到菌体细胞进行破碎，并用硫酸铵沉淀处理。通过酶固定化技术，将磷酸胆碱胞苷酰转移酶与载体树脂交联形成固定化磷酸胆碱胞苷酰转移酶。(6)在反应体系中添加包括胞苷酸及葡萄糖在内的底物原料。

17、在上述技术方案中，整个合成过程具体包括：菌体活化、固定化细胞的制备和固定化酶的制备、转化反应等四个过程，具体工艺流程见附图1。

18、微生物信息

19、本发明所使用酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.7397，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年4月1日，该保藏证明的原件用于申请中国专利cn103614308a，公布日为2014年3月5日。本发明具体实施例中所使用大肠杆菌基因工程菌，为本实验室所构建磷酸胆碱胞苷酰转移酶过表达工程菌株，菌种编号为txbl-001(本实验室菌种编号)。