包含microRNA适应的shRNA（shRNAmiR）的遗传修饰的免疫细胞的制作方法

本发明涉及肿瘤学、癌症免疫治疗、分子生物学和重组核酸。特别地，本发明涉及遗传修饰的免疫细胞，其包含能够稳定敲低特定靶基因的microrna适应的shrna(shrnamir)分子。本发明还涉及此类遗传修饰的免疫细胞用于在受试者中降低内源性蛋白的表达和治疗疾病(包括癌症)的用途。引用通过efs-web作为本文文件提交的序列表本技术包含已通过efs-web以ascii格式提交且在此通过引用整体并入的序列表。在2020年4月3日创建的所述ascii副本被命名为pbio-037wo_seq_list_4-20，并且大小为58,911字节。

背景技术：

1、t细胞过继免疫治疗是用于癌症治疗的有前景的方法。本文公开的免疫疗法治疗方法利用经遗传修饰的分离的人t细胞以增强其对特定肿瘤相关抗原的特异性。遗传修饰可能涉及嵌合抗原受体或外源性t细胞受体的表达，以将抗原特异性移植到t细胞上。与外源性t细胞受体相比，嵌合抗原受体的特异性来源于单克隆抗体的可变结构域。因此，表达嵌合抗原受体的t细胞(car t细胞)以主要组织相容性复合体非限制的方式诱导肿瘤免疫反应性。t细胞过继免疫疗法已被用作许多癌症的临床疗法，包括b细胞恶性肿瘤(例如，急性淋巴母细胞白血病、b细胞非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、晚期神经胶质瘤、卵巢癌、间皮瘤、黑色素瘤、前列腺癌和胰腺癌等。

2、尽管其具有作为癌症治疗的潜在有用性，但是用car t细胞的过继免疫疗法部分受到细胞表面上内源性t细胞受体的表达的限制。表达内源性t细胞受体的car t细胞在施用于同种异体患者后可识别主要和次要组织相容性抗原，这可以导致移植物抗宿主病(gvhd)的发展。因此，临床试验已主要集中在使用自体car t细胞，其中分离患者的t细胞，进行遗传修饰以并入嵌合抗原受体，然后重新输注至同一患者体内。自体方法提供对施用的car t细胞的免疫耐受性；然而，这种方法受到在患者已诊断为癌症之后产生患者特异性car t细胞所需的时间和费用两者的限制。

3、因此，开发使用来自第三方健康供体的t细胞制备的具有降低的内源性t细胞受体(例如，α/βt细胞受体)表达或不具有可检测的细胞表面表达且在施用后不引发gvhd的“现成的(off the shelf)”car t细胞将是有利的。这样的产品可以在诊断之前产生和验证，并且可以在一旦必要时可用于患者。因此，需要开发缺乏内源性t细胞受体以防止gvhd的发生的同种异体car t细胞。

4、为此，为了完全敲除β-2微球蛋白(b2m)蛋白表达，产生了对β-2微球蛋白基因具有特异性的工程化大范围核酸酶(参见，例如，国际公开号wo 2017/112859)。b2m是主要组织相容性复合体(mhc)i类分子的一个组成部分，如果没有b2m，其将不会在细胞表面组装。因此，敲除b2m是一种消除mhc i类分子的方法，当将car t细胞施用于同种异体患者时，这会减少gvhd。

5、然而，完全消除car t细胞表面上的b2m和mhc i类分子表达的结果是，所述car t细胞变得更容易受到自然杀伤(nk)细胞的攻击，自然杀伤细胞将其视为非自身的。鉴于这种现象，开发了一种针对car t细胞的敲低方法，以产生不完全的b2m敲低(参见，例如，国际公开号wo 2018/208837)。本质上，包含b2m靶向shrna编码序列的盒通过核酸酶介导的靶向插入引入t细胞的t细胞受体α恒定区基因。shrna编码序列包含在盒中，该盒也包含car编码序列，允许产生tcr阴性、car阳性的car t细胞，并且具有细胞表面b2m的部分敲低。该项目中的数据表明，与完全敲除b2m的car t细胞相比，这些car t细胞确实更不容易被nk细胞杀死。

6、然而，如本文所述，进一步的实验表明，包含shrna编码序列的盒不稳定，并且b2m敲低是暂时性的。最终，细胞从基因组中去除shrna编码序列，导致b2m表达回归。因此，仍然需要产生能够稳定敲低内源性蛋白(如b2m)的car t细胞。在本领域中寻找该问题的答案时，本文发现了一种技术，该技术可用于在免疫细胞中产生不同程度的目标蛋白的基因敲低。

技术实现思路

1、本发明提供了遗传修饰的免疫细胞(及其群体)，其表达降低靶蛋白表达的microrna适应的shrna(shrnamir)。使用shrnamir敲低靶蛋白的表达可以稳定敲低蛋白表达，这对于那些首选敲低而不是敲除的靶蛋白来说是理想的。例如，通过表达b2m靶向shrnamir来以降低水平表达β-2微球蛋白(b2m)的免疫细胞对自然杀伤(nk)细胞的细胞溶解作用比那些b2m表达已被基因失活敲除的细胞更不敏感。因此，进一步提供了通过引入包含编码shrnamir的核酸序列的模板核酸来降低免疫细胞中内源性蛋白表达的方法，所述核酸序列被插入到所述细胞的基因组中并被表达以降低所述内源性蛋白的表达。

2、因此，在一个方面中，本发明提供了一种遗传修饰的免疫细胞，其在基因组中包含编码microrna适应的shrna(shrnamir)的核酸序列。所述shrnamir在所述遗传修饰的免疫细胞中表达，并且在所述遗传修饰的免疫细胞中降低靶蛋白的表达。靶蛋白表达的降低由shrnamir引导序列与编码所述靶蛋白的mrna的结合来介导。

3、在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的t细胞，或由其衍生的细胞。在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的自然杀伤(nk)细胞，或由其衍生的细胞。在其他实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的b细胞，或由其衍生的细胞。在各种实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的单核细胞或巨噬细胞，或由其衍生的细胞。

4、在一些实施方式中，所述shrnamir从5’至3’包含：(a)5’mir支架结构域；(b)5’mir基干结构域；(c)随从链；(d)mir环结构域；(e)引导链；(f)3’mir基干结构域；和(g)3’mir支架结构域。

5、在一些实施方式中，所述mir环结构域是mir-30a环结构域、mir-15环结构域、mir-16环结构域、mir-155环结构域、mir-22环结构域、mir-103环结构域或mir-107环结构域。在特定实施方式中，所述mir环结构域是mir-30a环结构域。

6、在一些实施方式中，所述mir-30a环结构域包含与seq id no:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，所述mir-30a环结构域包含seq id no:3的核酸序列。

7、在一些实施方式中，所述shrnamir包含microrna-e(mir-e)支架、mir-30(例如mir-30a)支架、mir-15支架、mir-16支架、mir-155支架、mir-22支架、mir-103支架或mir-107支架。在一些实施方式中，所述shrnamir包含mir-e支架。

8、在一些实施方式中，所述shrnamir包含一种结构，其中：(a)所述5’mir支架结构域包含与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列；(b)所述5’mir基干结构域包含与seq id no:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列；(c)所述3’mir基干结构域包含与seq id no:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列；和/或(d)所述3’mir支架结构域包含与seq id no:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。

9、在一些实施方式中，所述shrnamir包含一种结构，其中：(a)所述5’mir支架结构域包含seq id no:1的核酸序列；(b)所述5’mir基干结构域包含seq id no:2的核酸序列；(c)所述3’mir基干结构域包含seq id no:4的核酸序列；和(d)所述3’mir支架结构域包含seqid no:5的核酸序列。

10、在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含编码嵌合抗原受体(car)或外源性t细胞受体(tcr)的核酸序列，其中所述car或所述外源性tcr由所述遗传修饰的免疫细胞表达。

11、在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含编码hla i类组织相容性抗原α链e(hla-e)融合蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，所述hla-e融合蛋白包含与seq id no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列。

12、在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列位于与编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列不同的基因内。在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列、或者编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列位于tcrα基因或tcrα恒定区基因内。在特定实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列、或者编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列在包含seq id no:58的序列内位于tcrα恒定区基因内。

13、在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列位于与编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列相同的基因内。在一些实施方式中，所述基因是tcrα基因或tcrα恒定区基因。在特定实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列在包含seq id no:58的序列内位于tcrα恒定区基因内。在一些实施方式中，编码shrnamir的核酸序列和编码car或外源性tcr的核酸序列在所述基因的盒内。在一些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与相同启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列；和(b)编码所述shrnamir的所述核酸序列。在其他此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)编码所述shrnamir的所述核酸序列；和(b)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列。在一些此类实施方式中，编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列被2a或ires序列所分隔。在某些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有相同定向。在其他此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有相反定向。在一些此类实施方式中，所述内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，和编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在一些此类实施方式中，所述盒包含与编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列可操作地连接的启动子。在一些此类实施方式中，所述盒包含终止信号。

14、在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列位于相同基因内。在一些实施方式中，所述基因是tcrα基因或tcrα恒定区基因。在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列在所述基因中的盒内。在一些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与相同启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列；和(b)编码所述shrnamir的所述核酸序列。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)编码所述shrnamir的所述核酸序列；和(b)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列。在一些此类实施方式中，编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列被2a或ires序列所分隔。在某些此类实施方式中，内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在一些此类实施方式中，所述盒包含启动子，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述盒包含终止信号。

15、在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列、编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列位于相同基因内。在一些实施方式中，所述基因是tcrα基因或tcrα恒定区基因。在一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列、编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列在所述基因中的盒内。在一些此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列、编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与相同启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含：(a)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列；(b)2a或ires序列；(c)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列；和(d)编码所述shrnamir的所述核酸序列。在一些此类实施方式中，内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在其他此类实施方式中，内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在一些此类实施方式中，所述盒包含与编码所述car或所述外源性tcr的核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列可操作地连接的启动子。在一些此类实施方式中，所述盒包含终止信号。

16、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列；(c)2a或ires序列；(d)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

17、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)2a或ires序列；(d)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

18、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)2a或ires序列；(d)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

19、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列；(c)2a或ires序列；(d)编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

20、在上文所述的一些实施方式中，所述内含子序列是合成内含子序列。在一些实施方式中，所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列。

21、在上文所述的一些实施方式中，所述终止信号是polya序列或牛生长激素(bgh)终止信号。在一些实施方式中，所述polya序列包含与seq id no:68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，所述polya序列包含seq id no:68的核酸序列。在一些实施方式中，所述bgh终止信号包含与seq id no:71具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，所述bgh终止信号包含seq id no:71的核酸序列。

22、在上文所述的一些实施方式中，所述启动子包含与seq id no:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，所述启动子包含seq id no:67的核酸序列。

23、在上文所述的一些实施方式中，所述2a序列是包含与seq idno:70具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的p2a/弗林蛋白酶位点。在特定实施方式中，所述2a序列是包含seq id no:70的核酸序列的p2a/弗林蛋白酶位点。

24、在上文所述的一些实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seq idno:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq id no:73的氨基酸序列。

25、在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)包含与seq id no:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的启动子；(b)编码所述car的所述核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seq id no:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列；(c)包含与seq idno:70具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的p2a/弗林蛋白酶位点；(d)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含与seq id no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，包含与seq id no:68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的终止信号，其中编码所述car的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

26、在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)包含seq id no:67的核酸序列的启动子；(b)编码所述car的所述核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq id no:73的氨基酸序列；(c)包含seq idno:70的核酸序列的p2a/弗林蛋白酶位点；(d)编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，包含seq id no:68的核酸序列的终止信号；其中编码所述car的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子地连接。

27、在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含与seq id no:74具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，其中所述盒在基因组中位于tcrα恒定区基因内。在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含seq id no:74的核酸序列，其中所述盒在基因组中位于tcrα恒定区基因内。

28、在上文所述的一些实施方式中，所述盒包含编码shrnamir的两个或更多个核酸。在一些实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码相同shrnamir。在一些实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码不同shrnamir，所述shrnamir降低相同靶蛋白的表达。在其他实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码不同shrnamir，所述shrnamir降低不同靶蛋白的表达。在一些实施方式中，所述盒可以包含编码本文所述的不同shrnamir的两个或更多个核酸。在特定实施方式中，所述盒可以包含编码降低b2m表达的shrnamir的核酸序列和编码降低cd52表达的shrnamir的核酸序列。

29、在一些实施方式中，编码shrnamir的核酸序列和编码car或外源性tcr的核酸序列位于相同基因中，并且与不同启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在其他此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码car或外源性tcr的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有相同定向。在其他此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有相反定向。在某些此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。在其他实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。在一些此类实施方式中，盒包含一个或多个终止信号。

30、在一些实施方式中，编码shrnamir的核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与不同启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在其他此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在某些此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。在其他此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。在一些此类实施方式中，盒包含一个或多个终止信号。

31、在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组内包含盒，所述盒包含：(a)编码car或外源性tcr的核酸序列；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(c)编码shrnamir的核酸序列；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组内包含盒，所述盒包含：(a)编码car或外源性tcr的核酸序列；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(c)编码shrnamir的核酸序列；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。在一些此类实施方式中，所述内含子序列位于编码car或外源性tcr的核酸序列，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在一些此类实施方式中，所述盒包含能够终止所述car或所述外源性tcr的转录的第一终止信号，和能够终止所述hla-e融合蛋白的转录的第二终止信号。在其他此类实施方式中，所述盒包含能够终止所述hla-e融合蛋白的转录的第一终止信号，和能够终止所述car或所述外源性tcr的转录的第二终止信号。

32、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

33、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，内并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码car或外源性tcr的核酸序列；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

34、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列，其中内含子序列位于编码car或外源性tcr的核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

35、在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码car或外源性tcr的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

36、在上文所述的一些实施方式中，所述内含子序列是合成内含子序列。在一些实施方式中，所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列。

37、在上文所述的一些实施方式中，一个或多个终止信号是polya序列或bgh终止信号。

38、在上文所述的一些实施方式中，所述第一终止信号和第二终止信号是相同的。在一些此类实施方式中，所述第一终止信号和所述第二终止信号是polya序列或bgh终止信号。

39、在上文所述的一些实施方式中，所述第一终止信号和所述第二终止信号是不同的。在一些实施方式中，第一终止信号是polya序列和第二终止信号是bgh终止信号。在一些实施方式中，第一终止信号是bgh终止信号和第二终止信号是polya序列。

40、在上文所述的一些实施方式中，polya序列包含与seq id no:68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，polya序列包含seq id no:68的核酸序列。在一些实施方式中，bgh终止信号包含与seq id no:71具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，bgh终止信号包含seq id no:71的核酸序列。

41、在上文所述的一些实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。在一些此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是jet启动子或ef1α核心启动子。

42、在上文所述的一些实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。在一些实施方式中，所述第一启动子是jet启动子，和所述第二启动子是ef1α核心启动子。在一些实施方式中，所述第一启动子是ef1α核心启动子，和所述第二启动子是jet启动子。

43、在上文所述的某些实施方式中，jet启动子包含与seq id no:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，jet包含seq id no:67的核酸序列。在一些实施方式中，ef1α核心启动子包含与seq id no:72具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，ef1α核心启动子包含seq id no:72的核酸序列。

44、在上文所述的一些实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seq idno:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq id no:73的氨基酸序列。

45、在一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)包含与seq id no:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第一启动子；(b)编码car的核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seq id no:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列；(c)任选地，包含与seq id no:70具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第一终止信号；(d)包含与seq idno:72具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含与seq id no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，其中所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，包含与seq id no:71具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第二终止信号；其中编码car的核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

46、在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒从5’至3’包含：(a)包含seq id no:67的核酸序列的第一启动子；(b)编码car的核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq id no:73的氨基酸序列；(c)任选地，包含seq idno:70的核酸序列的第一终止信号；(d)包含seq idno:72的核酸序列的第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，其中所述内含子序列包含seqid no:69的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，包含seq id no:71的核酸序列的第二终止信号；其中编码car的核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

47、在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含与seq id no:75具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，其中所述盒在基因组中位于tcrα恒定区基因内。在特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞在其基因组中包含盒，所述盒包含seq id no:75的核酸序列，其中所述盒在基因组中位于tcrα恒定区基因内。

48、在上文所述的一些实施方式中，盒包含编码shrnamir的两个或更多个核酸。在一些实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码相同shrnamir。在一些实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码不同shrnamir，所述shrnamir降低相同靶蛋白的表达。在其他实施方式中，所述两个或更多个核酸编码不同shrnamir，所述shrnamir降低不同靶蛋白的表达。在一些实施方式中，所述盒可以包含编码本文所述的不同shrnamir的两个或更多个核酸。在特定实施方式中，所述盒可以包含编码降低b2m表达的shrnamir的核酸序列，和编码降低cd52表达的shrnamir的核酸序列。

49、在一些实施方式中，与对照细胞相比，所述靶蛋白的表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％

50、在一些实施方式中，所述靶蛋白是β-2微球蛋白、cs1、转化生长因子-β受体2(tgfbr2)、cbl原癌基因b(cbl-b)、cd52、tcrα基因、tcrα恒定区基因、cd7、糖皮质激素受体(gr)、脱氧胞苷激酶(dck)、核受体亚家族2组f成员6(nr2f6)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)或c-c趋化因子受体5型(ccr5)。

51、在一些实施方式中，所述靶蛋白是β-2微球蛋白。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，β-2微球蛋白的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在进一步的实施方式中，与对照细胞相比，在细胞表面上mhc i类分子的表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞具有降低的同种异体性。

52、在一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq idno:17的核酸序列和引导链包含seq id no:18的核酸序列；(b)随从链包含seq id no:7的核酸序列和引导链包含seq id no:8的核酸序列；(c)随从链包含seq id no:19的核酸序列和引导链包含seq id no:10的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:11的核酸序列和引导链包含seq id no:12的核酸序列；(e)随从链包含seq id no:13的核酸序列和引导链包含seq id no:14的核酸序列；或者(f)随从链包含seq id no:15的核酸序列和引导链包含seqid no:16的核酸序列。在某些此类实施方式中，随从链包含seq id no:17的核酸序列和引导链包含seq id no:18的核酸序列。在特定的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在其他此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:46的序列。

53、在一些实施方式中，所述靶蛋白是cs1。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，cs1的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在一些此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞表达对cs1具有特异性的car。在其他此类实施方式中，与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞较不容易被表达对cs1具有特异性的car的遗传修饰的免疫细胞误杀。

54、在一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq idno:21的核酸序列和引导链包含seq id no:22的核酸序列；(b)随从链包含seq id no:23的核酸序列和引导链包含seq id no:24的核酸序列；或者(c)随从链包含seq id no:25的核酸序列和引导链包含seq id no:26的核酸序列。在某些此类实施方式中，随从链包含seqid no:25的核酸序列和引导链包含seq id no:26的核酸序列。在特定的此类实施方式中，shrnamir包含与seq id no:50具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在其他此类实施方式中，shrnamir包含seq id no:50的序列。

55、在一些实施方式中，所述靶蛋白是tgfbr2。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，tgfbr2的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在进一步的实施方式中，与对照细胞相比，所述遗传修饰的免疫细胞对转化生长因子b1(tgfb1)的免疫抑制较不敏感。

56、在一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq idno:27的核酸序列和引导链包含seq id no:28的核酸序列；(b)随从链包含seq id no:29的核酸序列和引导链包含seq id no:30的核酸序列；(c)随从链包含seq id no:31的核酸序列和引导链包含seq id no:32的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:33的核酸序列和引导链包含seq id no:34的核酸序列；或者(e)随从链包含seq id no:35的核酸序列和引导链包含seq id no:36的核酸序列。在某些此类实施方式中，随从链包含seq id no:31的核酸序列和引导链包含seq id no:32的核酸序列。在特定的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq idno:53具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在其他此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:53的序列。

57、在一些实施方式中，所述靶蛋白是cbl-b。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，cbl-b的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在其他此类实施方式中，与对照细胞相比，免疫细胞较不易受下游信号传导蛋白降解而导致的t细胞受体(tcr)信号传导抑制的影响。

58、在一些实施方式中，所述靶蛋白是cd52。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，cd52的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在进一步的实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞对cd52抗体诱导的细胞死亡较不敏感。

59、在一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq idno:37的核酸序列和引导链包含seq id no:38的核酸序列；或者(b)随从链包含seq id no:39的核酸序列和引导链包含seq id no:40的核酸序列。在某些此类实施方式中，随从链包含seq id no:37的核酸序列和引导链包含seq id no:38的核酸序列。在特定的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:56具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在其他此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:56的序列。

60、在一些实施方式中，所述靶蛋白是dck。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，dck的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在其他此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞对嘌呤核苷酸类似物(例如，氟达拉滨)在细胞增殖上的影响较不敏感。

61、在一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq idno:76的核酸序列和引导链包含seq id no:77的核酸序列；(b)随从链包含seq id no:78的核酸序列和引导链包含seq id no:79的核酸序列；(c)随从链包含seq id no:80的核酸序列和引导链包含seq id no:81的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:82的核酸序列和引导链包含seq id no:83的核酸序列；或者(e)随从链包含seq id no:84的核酸序列和引导链包含seq id no:85的核酸序列。在特定的此类实施方式中，随从链包含seq id no:76的核酸序列和引导链包含seq id no:77的核酸序列。在特定的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:86具有具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在其他此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seqid no:86的序列。

62、在一些实施方式中，所述靶蛋白是gr。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，gr的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在其他此类实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞对糖皮质激素(例如，地塞米松)的影响(如增殖减少)较不敏感。

63、在一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq idno:91的核酸序列和引导链包含seq id no:92的核酸序列；(b)随从链包含seq id no:93的核酸序列和引导链包含seq id no:94的核酸序列；(c)随从链包含seq id no:95的核酸序列和引导链包含seq id no:96的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:97的核酸序列和引导链包含seq id no:98的核酸序列；(e)随从链包含seq id no:99的核酸序列和引导链包含seq id no:100的核酸序列；(f)随从链包含seq id no:101的核酸序列和引导链包含seqid no:102的核酸序列；(g)随从链包含seq id no:103的核酸序列和引导链包含seq idno:104的核酸序列；(h)随从链包含seq id no:105的核酸序列和引导链包含seq idno:106的核酸序列；或者(i)随从链包含seq id no:107的核酸序列和引导链包含seq id no:108的核酸序列。在特定的此类实施方式中，随从链包含seq id no:95的核酸序列和引导链包含seq idno:96的核酸序列。在特定的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:111具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在其他此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:111的序列。

64、在另一个方面中，本发明提供了一种用于降低免疫细胞中内源性蛋白的表达的方法，所述方法包括将包含编码shrnamir的核酸序列的模板核酸引入所述免疫细胞中，其中将所述模板核酸插入所述免疫细胞的基因组中。在所述免疫细胞中所述shrnamir被表达，并且所述免疫细胞中内源性靶蛋白的表达降低。靶蛋白表达的降低是由shrnamir引导序列与编码靶蛋白的mrna结合介导的。

65、在所述方法的一些实施方式中，免疫细胞是t细胞，或由其衍生的细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是自然杀伤(nk)细胞，或由其衍生的细胞。在其他实施方式中，免疫细胞是b细胞，或由其衍生的细胞。在各种实施方式中，免疫细胞是单核细胞或巨噬细胞，或由其衍生的细胞。

66、在所述方法的一些实施方式中，通过随机整合将所述模板核酸插入所述免疫细胞的所述基因组中。在所述方法的一些此类实施方式中，使用病毒载体(即，重组病毒)将所述模板核酸引入所述免疫细胞中，如慢病毒载体(即，重组慢病毒)。

67、在所述方法的一些实施方式中，所述免疫细胞表达car或外源性tcr。

68、在一些实施方式中，所述方法进一步包括将编码对免疫细胞基因组中的识别序列具有特异性的工程化核酸酶的第二核酸引入免疫细胞中。工程化核酸酶在免疫细胞中表达，并在识别序列处产生切割位点。包含编码shrnamir的核酸序列的模板核酸在切割位点处插入免疫细胞的基因组中。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸的侧翼是与所述识别位点侧翼的序列具有同源性的同源臂，并且其中通过同源重组在所述切割位点处插入所述模板核酸。在所述方法的一些此类实施方式中，使用病毒载体(即，重组病毒)将模板核酸引入免疫细胞中。在一些此类实施方式中，病毒载体是重组aav载体(即，重组aav)。在特定实施方式中，重组aav载体具有血清型aav2或aav6。在所述方法的一些此类实施方式中，识别序列在靶基因内。在所述方法的一些此类实施方式中，在免疫细胞中由靶基因编码的蛋白的表达被破坏。在所述方法的某些此类实施方式中，靶基因是tcrα基因或tcrα恒定区基因，并且免疫细胞不具有可检测的内源性tcr(例如，α/βtcr)的细胞表面表达。在所述方法的一些此类实施方式中，工程化核酸酶是工程化大范围核酸酶、锌指核酸酶、talen、致密talen、crispr系统核酸酶或megatal。在所述方法的特定此类实施方式中，工程化核酸酶是工程化大范围核酸酶。在所述方法的某些此类实施方式中，编码工程化核酸酶的第二核酸是使用mrna引入的。

69、在所述方法的一些实施方式中，模板核酸被引入其中的免疫细胞在其基因组中进一步包含编码car或外源性tcr的核酸序列。在所述方法的某些实施方式中，模板核酸被引入其中的免疫细胞在其基因组中进一步包含编码hla-e融合蛋白的核酸序列。

70、在所述方法的一些实施方式中，模板核酸进一步包含编码car或外源性tcr的核酸序列，其中所述car或所述外源性tcr由所述免疫细胞表达。在一些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列在所述切割位点处引入所述模板核酸后在所述免疫细胞中与相同启动子可操作地连接。在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)编码car或外源性tcr的核酸序列；和(b)编码shrnamir的核酸序列。在所述方法的其他此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)编码shrnamir的核酸序列；和(b)编码car或外源性tcr的核酸序列。在所述方法的某些此类实施方式中，编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列被2a或ires序列分隔。在所述方法的一些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有相同定向。在所述方法的其他此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列和编码car或外源性tcr的核酸序列是不同的。在所述方法的一些此类实施方式中，所述内含子序列位于编码car或外源性tcr的核酸序列，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在所述方法的某些此类实施方式中，所述模板核酸包含启动子，其中所述启动子与编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和与编码所述shrnamir的所述核酸序列可操作地连接。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含终止信号。

71、在所述方法的一些实施方式中，所述模板核酸包含编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白由所述免疫细胞表达。在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列在所述切割位点处引入后在所述免疫细胞中与相同启动子可操作地连接。在所述方法的某些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(b)编码shrnamir的核酸序列。在所述方法的其他此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)编码shrnamir的核酸序列；和(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列。在所述方法的一些此类实施方式中、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列被2a或ires序列所分隔。在所述方法的某些此类实施方式中，所述内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含启动子，其中所述启动子与编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和与编码所述shrnamir的所述核酸序列可操作地连接。在所述方法的某些此类实施方式中，所述模板核酸包含终止信号。

72、在所述方法的一些实施方式中，所述模板核酸包含编码car或外源性tcr的核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列，其中car或外源性tcr和hla-e融合蛋白由所述免疫细胞表达。在所述方法的一些实施方式中，编码shrnamir的核酸序列，编码car或外源性tcr的核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列在所述切割位点处引入后在所述免疫细胞中与相同启动子可操作地连接。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含：(a)编码car或外源性tcr的核酸序列；(b)2a或ires序列；(c)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(d)编码shrnamir的核酸序列。在所述方法的某些此类实施方式中，所述内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在所述方法的其他此类实施方式中，所述内含子序列位于编码car或外源性tcr的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含与编码car或外源性tcr的核酸序列、编码hla-e融合蛋白的核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列可操作地连接的启动子。在所述方法的某些此类实施方式中，所述模板核酸包含终止信号。

73、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列；(c)2a或ires序列；(d)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

74、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)2a或ires序列；(d)编码car或外源性tcr的核酸序列；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

75、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)2a或ires序列；(d)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

76、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；(c)2a或ires序列；(d)编码car或外源性tcr的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

77、在上文所述方法的一些实施方式中，所述内含子序列是合成内含子序列。在所述方法的某些实施方式中，所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列。

78、在上文所述方法的一些实施方式中，所述终止信号是polya序列或牛生长激素(bgh)终止信号。在所述方法的某些实施方式中，polya序列包含与seq id no:68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，polya序列包含seq id no:68的核酸序列。在所述方法的某些实施方式中，bgh终止信号包含与seq id no:71具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，bgh终止信号包含seq id no:71的核酸序列。

79、在上述所述方法的某些实施方式中，所述启动子包含与seq idno:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，所述启动子包含seq id no:67的核酸序列。

80、在上述所述方法的某些实施方式中，所述2a序列是p2a/弗林蛋白酶位点包含与seq id no:70具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，所述2a序列是p2a/弗林蛋白酶位点包含seq id no:70的核酸序列。

81、在上述所述方法的某些实施方式中，hla-e融合蛋白包含与seq id no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在所述方法的特定实施方式中，hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列。

82、在上述所述方法的某些实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seqid no:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在所述方法的特定实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq id no:73的氨基酸序列。

83、在所述方法的特定实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)包含与seq id no:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的启动子；(b)编码car的核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seq id no:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列；(c)包含与seq idno:70具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的p2a/弗林蛋白酶位点；(d)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含与seqid no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，其中所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，包含与seq id no:68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的终止信号；其中编码所述car的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

84、在所述方法的特定实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)包含seq id no:67的核酸序列的启动子；(b)编码car的核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含seqid no:73的氨基酸序列；(c)包含seq id no:70的核酸序列的p2a/弗林蛋白酶位点；(d)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(e)任选地，包含seq idno:68的核酸序列的终止信号；其中编码所述car的所述核酸序列、编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

85、在所述方法的特定实施方式中，所述模板核酸包含与seq id no:74具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，其中所述模板核酸插入到基因组中tcrα恒定区基因内。在所述方法的特定实施方式中，所述模板核酸包含seqid no:74的核酸序列，其中所述模板核酸插入到基因组中tcrα恒定区基因内。

86、在上文所述方法的一些实施方式中，所述模板核酸包含编码shrnamir的两个或更多个核酸。在所述方法的某些实施方式中，所述两个或多个核酸可以编码相同shrnamir。在所述方法的一些实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码不同shrnamir，所述shrnamir降低相同靶蛋白的表达。在所述方法的其他实施方式中，两个或更多个核酸编码不同shrnamir，所述shrnamir降低不同靶蛋白的表达。在所述方法的某些实施方式中，模板核酸可以包含编码本文所述的不同shrnamir的两个或更多个核酸。在所述方法的特定实施方式中，模板核酸可以包含编码降低b2m表达的shrnamir的核酸序列，编码降低cd52表达的shrnamir的核酸序列。

87、在所述方法的一些实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列在所述切割位点处引入后在所述免疫细胞中与不同启动子可操作地连接。在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在所述方法的其他此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码car或外源性tcr的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在所述方法的某些此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列与编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有相同定向。在所述方法的其他此类实施方式中，编码所述shrnamir的所述核酸序列和编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列具有不同定向。在所述方法的特定此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。在所述方法的其他此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含一个或多个终止信号。

88、在所述方法的一些实施方式中，编码shrnamir的核酸序列和编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列在所述切割位点处引入后在所述免疫细胞中与不同启动子可操作地连接。在所述方法的某些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码shrnamir的核酸序列，其与所述第一启动子可操作地连接；(c)第二启动子；和(d)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其与所述第二启动子可操作地连接。在所述方法的某些此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。在所述方法的其他此类实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含一个或多个终止信号。

89、在所述方法的一些实施方式中，所述模板核酸包含：(a)编码car或外源性tcr的核酸序列；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(c)编码shrnamir的核酸序列；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。在所述方法的一些实施方式中，所述内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。在所述方法的一些实施方式中，所述模板核酸包含：(a)编码car或外源性tcr的核酸序列；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(c)编码shrnamir的核酸序列；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。在所述方法的一些实施方式中，所述内含子序列位于编码car或外源性tcr的核酸序列，其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内。

90、在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含能够终止所述car或所述外源性tcr的转录的第一终止信号，和能够终止所述hla-e融合蛋白的转录的第二终止信号。在所述方法的一些此类实施方式中，所述模板核酸包含能够终止所述hla-e融合蛋白的转录的第一终止信号，和能够终止所述car或所述外源性tcr的转录的第二终止信号。

91、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

92、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码car或外源性tcr的核酸序列；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

93、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码car或外源性tcr的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

94、在所述方法的一些此类实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)第一启动子；(b)编码hla-e融合蛋白的核酸序列；(c)任选地，第一终止信号；(d)第二启动子；(e)编码car或外源性tcr的核酸序列，其中内含子序列位于编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列内，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，第二终止信号；其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述car或所述外源性tcr的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

95、在上文所述方法的一些实施方式中，所述内含子序列是合成内含子序列。在所述方法的某些实施方式中，所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列。

96、在上文所述方法的一些实施方式中，一种或多种末端信号是polya序列或bgh终止信号。

97、在上文所述方法的一些实施方式中，所述第一终止信号和所述第二终止信号是相同的。在所述方法的其他实施方式中，所述第一终止信号和所述第二终止信号是不同的。在所述方法的某些实施方式中，第一终止信号是polya序列和第二终止信号是bgh终止信号。在所述方法的某些实施方式中，第一终止信号是bgh终止信号和第二终止信号是polya序列。

98、在上述所述方法的某些实施方式中，polya序列包含与seq idno:68具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，polya序列包含seq id no:68的核酸序列。在所述方法的某些实施方式中，bgh终止信号包含与seq id no:71具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，bgh终止信号包含seq id no:71的核酸序列。

99、在上文所述方法的一些实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。在所述方法的其他实施方式中，所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。在所述方法的某些实施方式中，所述第一启动子是jet启动子，和所述第二启动子是ef1α核心启动子。在所述方法的某些实施方式中，所述第一启动子是ef1α核心启动子，和所述第二启动子是jet启动子。

100、在上述所述方法的某些实施方式中，jet启动子包含与seq idno:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，jet启动子包含seq id no:67的核酸序列。在所述方法的某些实施方式中，ef1α核心启动子包含与seq id no:72具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在特定实施方式中，ef1α核心启动子包含seq id no:72的核酸序列。

101、在上文所述方法的一些实施方式中，hla-e融合蛋白包含与seq id no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在所述方法的特定实施方式中，hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列。

102、在上文所述方法的一些实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seqid no:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。在所述方法的特定实施方式中，所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq id no:73的氨基酸序列。

103、在所述方法的特定实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)包含与seq id no:67具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第一启动子；(b)编码car的核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含与seq id no:73具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列；(c)任选地，包含与seq id no:70具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第一终止信号；(d)包含与seq id no:72具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e容恶化蛋白包含与seq id no:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，其中所述内含子序列包含与seq id no:69具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，包含与seq id no:71具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列的第二终止信号；其中编码car的核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

104、在所述方法的特定实施方式中，模板核酸从5’至3’包含：(a)包含seq id no:67的核酸序列的第一启动子；(b)编码所述car的所述核酸序列，其中所述car包含信号肽，所述信号肽包含seq idno:73的氨基酸序列；(c)任选地，包含seq id no:70的核酸序列的第一终止信号；(d)包含seq id no:72的核酸序列的第二启动子；(e)编码hla-e融合蛋白的核酸序列，其中所述hla-e融合蛋白包含seq id no:66的氨基酸序列，并且其中内含子序列位于编码hla-e融合蛋白的核酸序列内，其中所述内含子序列包含seq id no:69的核酸序列，并且其中编码所述shrnamir的所述核酸序列位于所述内含子序列内；和(f)任选地，包含seqid no:71的核酸序列的第二终止信号；其中编码car的核酸序列与所述第一启动子可操作地连接，并且其中编码所述hla-e融合蛋白的所述核酸序列和编码所述shrnamir的所述核酸序列与所述第二启动子可操作地连接。

105、在所述方法的特定实施方式中，所述模板核酸包含与seq id no:75具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列，其中所述盒插入到基因组中tcrα恒定区基因内。在所述方法的特定实施方式中，所述模板核酸包含seq id no:75的核酸序列，其中所述盒插入到基因组中tcrα恒定区基因内。

106、在上文所述方法的一些实施方式中，所述模板核酸包含编码shrnamir的两个或更多个核酸。在所述方法的某些实施方式中，所述两个或更多个核酸可以编码相同shrnamir。在所述方法的一些实施方式中，两个或更多个核酸可以编码不同shrnamir，所述shrnamir降低相同靶蛋白的表达。在所述方法的其他实施方式中，两个或更多个核酸可以编码不同shrnamir，所述shrnamir降低不同靶蛋白的表达。在所述方法的某些实施方式中，模板核酸可以包含编码本文所述的不同shrnamir的两个或更多个核酸。在所述方法的特定实施方式中，模板核酸可以包含编码降低b2m表达的shrnamir的核酸序列，和编码降低cd52表达的shrnamir的核酸序列。

107、在所述方法的一些实施方式中，shrnamir从5’至3’包含：(a)5’mir支架结构域；(b)5’mir基干结构域；(c)随从链；(d)mir环结构域；(e)引导链；(f)3’mir基干结构域；和(g)3’mir支架结构域。

108、在所述方法的一些实施方式中，mir环结构域是mir-30a环结构域、mir-15环结构域、mir-16环结构域、mir-155环结构域、mir-22环结构域、mir-103环结构域或mir-107环结构域。在所述方法的特定实施方式中，mir环结构域是mir-30a环结构域。

109、在所述方法的某些实施方式中，mir-30a环结构域包含与seq idno:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。在所述方法的特定实施方式中，mir-30a环结构域包含seq id no:3的核酸序列。

110、在所述方法的一些实施方式中，shrnamir包含microrna-e(mir-e)支架、mir-30(例如mir-30a)支架、mir-15支架、mir-16支架、mir-155支架、mir-22支架、mir-103支架或mir-107支架。在所述方法的某些实施方式中，shrnamir包含mir-e支架。

111、在所述方法的一些实施方式中，shrnamir包含一种结构，其中：(a)5’mir支架结构域包含与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列；(b)5’mir基干结构域包含与seq id no:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列；(c)3’mir基干结构域包含与seq id no:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列；和/或(d)3’mir支架结构域包含与seq id no:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的核酸序列。

112、在所述方法的某些实施方式中，shrnamir包含一种结构，其中：(a)5’mir支架结构域包含seq id no:1的核酸序列；(b)5’mir基干结构域包含seq id no:2的核酸序列；(c)3’mir基干结构域包含seq id no:4的核酸序列；和(d)3’mir支架结构域包含seq id no:5的核酸序列。

113、在所述方法的一些实施方式中，与对照细胞相比，所述靶蛋白的表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。

114、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是β-2微球蛋白、cs1、转化生长因子-β受体2(tgfbr2)、cbl原癌基因b(cbl-b)、cd52、tcrα基因、tcrα恒定区基因、cd7、糖皮质激素受体(gr)、脱氧胞苷激酶(dck)、核受体亚家族2组f成员6(nr2f6)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)或c-c趋化因子受体5型(ccr5)。

115、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是β-2微球蛋白。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，β-2微球蛋白的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法进一步的此类实施方式中，与对照细胞相比，在细胞表面上mhc i类分子的表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，免疫细胞具有降低的同种异体性。

116、在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq id no:17的核酸序列和引导链包含seq id no:18的核酸序列；(b)随从链包含seqid no:7的核酸序列和引导链包含seq id no:8的核酸序列；(c)随从链包含seq id no:9的核酸序列和引导链包含seq id no:10的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:11的核酸序列和引导链包含seq id no:12的核酸序列；(e)随从链包含seq id no:13的核酸序列和引导链包含seq id no:14的核酸序列；或者(f)随从链包含seq id no:15的核酸序列和引导链包含seq id no:16的核酸序列。在所述方法的某些此类实施方式中，随从链包含seq idno:17的核酸序列和引导链包含seq id no:18的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在所述方法进一步的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:46的序列。

117、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是cs1。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，cs1的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法的一些此类实施方式中，免疫细胞表达对cs1具有特异性的car。在所述方法进一步的此类实施方式中，与对照细胞相比，免疫细胞较不容易被表达对cs1具有特异性的car的遗传修饰的免疫细胞误杀。

118、在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq id no:21的核酸序列和引导链包含seq id no:22的核酸序列；(b)随从链包含seqid no:23的核酸序列和引导链包含seq id no:24的核酸序列；或者(c)随从链包含seq idno:25的核酸序列和引导链包含seq id no:26的核酸序列。在所述方法的某些此类实施方式中，随从链包含seq id no:25的核酸序列和引导链包含seq id no:26的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，shrnamir包含与seq id no:50具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在所述方法进一步的此类实施方式中，shrnamir包含seq id no:50的序列。

119、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是tgfbr2。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，tgfbr2的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法进一步的此类实施方式中，与对照细胞相比，免疫细胞对转化生长因子b1(tgfb1)的免疫抑制较不敏感。

120、在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq id no:27的核酸序列和引导链包含seq id no:28的核酸序列；(b)随从链包含seqid no:29的核酸序列和引导链包含seq id no:30的核酸序列；(c)随从链包含seq idno:31的核酸序列和引导链包含seq id no:32的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:33的核酸序列和引导链包含seq id no:34的核酸序列；或者(e)随从链包含seq id no:35的核酸序列和引导链包含seq id no:36的核酸序列。在所述方法的某些此类实施方式中，随从链包含seq id no:31的核酸序列和引导链包含seq idno:32的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:53具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高同一性的序列。在所述方法进一步的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:53的序列。

121、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是cbl-b。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，cbl-b的细胞表面表达cbl-b降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法进一步的此类实施方式中，与对照细胞相比，免疫细胞较不易受下游信号传导蛋白降解而导致的t细胞受体(tcr)信号传导抑制的影响。

122、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是cd52。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，cd52的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法进一步的此类实施方式中，免疫细胞对cd52抗体诱导的细胞死亡较不敏感。

123、在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq id no:37的核酸序列和引导链包含seq id no:38的核酸序列；或者(b)随从链包含seq id no:39的核酸序列和引导链包含seq id no:40的核酸序列。在所述方法的某些此类实施方式中，随从链包含seq id no:37的核酸序列和引导链包含seq id no:38的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:56具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在所述方法进一步的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:56的序列。

124、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是dck。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，dck的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在所述方法进一步的此类实施方式中，免疫细胞对嘌呤核苷酸类似物(例如，氟达拉滨)在细胞增殖上的影响较不敏感。

125、在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq id no:76的核酸序列和引导链包含seq id no:77的核酸序列；(b)随从链包含seqid no:78的核酸序列和引导链包含seq id no:79的核酸序列；(c)随从链包含seq idno:80的核酸序列和引导链包含seq id no:81的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:82的核酸序列和引导链包含seq id no:83的核酸序列；或者(e)随从链包含seq id no:84的核酸序列和引导链包含seq id no:85的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，随从链包含seq id no:76的核酸序列和引导链包含seq idno:77的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:86具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在所述方法进一步的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq id no:86的序列。

126、在所述方法的一些实施方式中，所述靶蛋白是gr。在所述方法的一些此类实施方式中，与对照细胞相比，gr的细胞表面表达降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多约99％。在其他此类实施方式中，免疫细胞对糖皮质激素(例如，地塞米松)在细胞增殖上的影响较不敏感。

127、在所述方法的一些此类实施方式中，shrnamir具有一种结构，其中：(a)随从链包含seq id no:91的核酸序列和引导链包含seq id no:92的核酸序列；(b)随从链包含seqid no:93的核酸序列和引导链包含seq id no:94的核酸序列；(c)随从链包含seq idno:95的核酸序列和引导链包含seq id no:96的核酸序列；(d)随从链包含seq id no:97的核酸序列和引导链包含seq id no:98的核酸序列；(e)随从链包含seq id no:99的核酸序列和引导链包含seq id no:100的核酸序列；(f)随从链包含seq id no:101的核酸序列和引导链包含seq id no:102的核酸序列；(g)随从链包含seq id no:103的核酸序列和引导链包含seq id no:104的核酸序列；(h)随从链包含seq id no:105的核酸序列和引导链包含seqid no:106的核酸序列；或者(i)随从链包含seq id no:107的核酸序列和引导链包含seqid no:108的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，随从链包含seq id no:95的核酸序列和引导链包含seq id no:96的核酸序列。在所述方法的特定此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含与seq id no:111具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列同一性的序列。在所述方法进一步的此类实施方式中，编码shrnamir的核酸序列包含seq idno:111的序列。

128、在另一个方面中，本发明提供了通过根据本文所述的任何方法制备的免疫细胞。在一些实施方式中，通过所述方法制备的靶蛋白是β-2微球蛋白和免疫细胞降低β-2微球蛋白和/或mhc i类蛋白的细胞表面表达。在一些实施方式中，所述靶蛋白是cs1，并且通过所述方法制备的免疫细胞具有降低的cs1细胞表面表达。在一些实施方式中，所述靶蛋白是tgfrb2，并且通过所述方法制备的免疫细胞具有降低的tgfrb2细胞表面表达。在一些实施方式中，所述靶蛋白是cbl-b，并且通过所述方法制备的免疫细胞具有降低的cbl-b细胞表面表达。在一些实施方式中，所述靶蛋白是cd52，并且通过所述方法制备的免疫细胞具有降低的cd52细胞表面表达。在一些实施方式中，所述靶蛋白是dck，并且通过所述方法制备的免疫细胞具有降低的dck细胞表面表达。在一些实施方式中，所述靶蛋白是gr，并且通过所述方法制备的免疫细胞具有降低的gr细胞表面表达。

129、在另一个方面中，本发明提供了一种细胞群体，所述细胞群体包含本文所述的多个遗传修饰的免疫细胞或多个免疫细胞。在一些实施方式中，在所述群体中至少约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或至多100％的细胞是本文所述的遗传修饰的免疫细胞或本文所述的免疫细胞。

130、在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及本文所述的多种遗传修饰的免疫细胞或本文所述的多种免疫细胞。在一些实施方式中，药物组合物包含本文所述的细胞群体。

131、在另一个方面中，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗疾病的免疫疗法的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，所述方法是用于在有需要的受试者中治疗癌症的免疫疗法，其中所述遗传修饰的免疫细胞或所述免疫细胞是遗传修饰的人t细胞或其衍生的细胞，或者遗传修饰的nk细胞或其衍生的细胞，并且其中所述遗传修饰的免疫细胞或所述免疫细胞包含car或外源性tcr，其中所述car或所述外源性tcr包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的胞外配体结合结构域。在所述方法的一些实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞或免疫细胞包含失活的tcrα基因或失活的tcrα恒定区基因。在所述方法的其他实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞或免疫细胞不具有可检测的内源性tcr(例如，α/βtcr)的细胞表面表达。在所述方法的一些实施方式中，癌症是选自以下的癌症：癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。在所述方法的某些实施方式中，癌症选自以下：b细胞起源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。在所述方法的特定实施方式中，b细胞起源的癌症选自以下：b谱系急性淋巴母细胞性白血病、b细胞慢性淋巴细胞性白血病、b细胞非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

132、在所述方法的特定实施方式中，受试者可以是哺乳动物，如人。

133、在另一个方面中，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗疾病(如癌症)的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的任何遗传修饰的免疫细胞(例如，表达car或外源性tcr的遗传修饰的人t细胞或nk细胞)群体，所述免疫细胞群体在其基因组中包含编码shrnamir的核酸序列，所述shrnamir降低内源性脱氧胞苷激酶(dck)的表达，其中在施用嘌呤核苷之前、期间或之后，向所述受试者施用遗传修饰的免疫细胞群体。shrnamir对dck表达的降低降低了嘌呤核苷对遗传修饰免疫细胞的增殖或体内持久性的影响。

134、在所述方法的特定实施方式中，施用遗传修饰的免疫细胞群体和嘌呤核苷，以使得当施用嘌呤核苷时，或者当嘌呤核苷以有效水平在受试者中存在时，在所述受试者中存在遗传修饰的免疫细胞(即，未被宿主清除)。在所述方法的一些实施方式中，嘌呤核苷是氟达拉滨。在所述方法的一些此类实施方式中，氟达拉滨单独施用或与另一种化疗化合物联合施用，作为免疫疗法的淋巴清除方案的一部分。

135、在所述方法的特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是表达对靶向的癌细胞上的抗原具有特异性的car或外源性tcr的遗传修饰的人t细胞或遗传修饰的nk细胞。

136、在另一个方面中，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗疾病(如癌症)的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的任何遗传修饰的免疫细胞(例如，表达car或外源性tcr的遗传修饰的人t细胞或nk细胞)群体，所述免疫细胞群体在其基因组中包含编码shrnamir的核酸序列，所述shrnamir降低内源性糖皮质激素受体(gr)的表达，其中在施用皮质类固醇之前、期间或之后，向所述受试者施用遗传修饰的免疫细胞群体。shrnamir对gr表达的降低降低了糖皮质激素对遗传修饰免疫细胞的增殖或体内持久性的影响。

137、在所述方法的特定实施方式中，施用遗传修饰的免疫细胞群体和糖皮质激素，以使得当施用糖皮质激素时，或者当糖皮质激素以有效水平在受试者中存在时，在所述受试者中存在遗传修饰的免疫细胞(即，未被宿主清除)。在所述方法的一些实施方式中，糖皮质激素是地塞米松或甲泼尼龙。在所述方法的一些此类实施方式中，糖皮质激素单独施用或与另一种化合物联合施用，作为免疫疗法期间减少细胞因子释放综合征的治疗的一部分。

138、在所述方法的特定实施方式中，所述遗传修饰的免疫细胞是表达对靶向的癌细胞上的抗原具有特异性的car或外源性tcr的遗传修饰的人t细胞或遗传修饰的nk细胞。

139、在另一个方面中，本发明提供了如本文所述的遗传修饰的免疫细胞或其群体，或者如本文所述的免疫细胞或其群体用作药物的用途。本发明还提供了如本文所述的遗传修饰的免疫细胞或其群体或者如本文所述的免疫细胞或其群体在制备用于在有需要的受试者中治疗疾病的药物中的用途。在一个此类方法中，所述药物是用于治疗癌症的。

140、在另一个方面中，本发明提供了如本文所述的遗传修饰的细胞或其群体或者如本文所述的免疫细胞或其群体用于治疗疾病的用途，优选地用于治疗癌症。