一种苏云金杆菌及其在抑制畜禽饲料霉菌中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种苏云金杆菌及其在抑制畜禽饲料霉菌中的应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.霉菌毒素(黄曲霉毒素、呕吐毒素等)是由某些曲霉真菌产生的次级代谢产物，具有较强的致畸、致癌、致突变作用。黄曲霉菌是重要的仓储霉菌，由其产生的黄曲霉毒素b1毒性极强，能严重损害畜禽机体的消化机能和免疫系统。畜禽饲料由于存放和使用环境一般比较恶劣，温湿度高，发生霉变的可能性很高，畜禽饲料的霉变很容易导致黄曲霉毒素等霉菌毒素的生成，影响饲料转化率，降低畜禽生产性能，并且这些霉菌毒素能够在畜禽肝脏、肾脏、肌肉等器官和组织中蓄积，严重危害畜禽健康以及人类的食品安全。


技术实现要素：

3.本发明为了解决畜禽饲料的霉菌毒素污染严重问题，提供一种苏云金杆菌及其在抑制畜禽饲料霉菌中的应用，该苏云金杆菌可以有效抑制霉菌的菌丝生长和孢子产生，对畜禽饲料中的霉菌抑制效果显著。
4.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
5.本发明的目的之一在于提供一种苏云金杆菌(bacillus thuringiensis)，该菌株命名为zhu-64，已提交菌种保藏。
6.【生物保藏说明】保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年07月25日；保藏编号：cctcc no：m20221173；分类命名：苏云金芽孢杆菌 zhu-64bacillus thuringiensiszhu-64。
[0007][0008][0009][0010][0011][0012]
本发明的苏云金杆菌zhu-64的16s rdna具有序列表seq id no：1所示的核苷酸序列。
[0013]
本发明的目的之二在于提供上述苏云金杆菌在抑制畜禽饲料霉菌中的应用。
[0014]
进一步，所述饲料包括玉米。
[0015]
本发明从寿光生态养猪场分离获得一株细菌，鉴定其为苏云金杆菌(bacillus thuringiensis)，将其命名为苏云金杆菌zhu-64。
[0016]
苏云金杆菌zhu-64在na培养基上25℃条件下培养48h，菌落为圆形或者椭圆形，边
缘不规则，不透明微隆起呈滴蜡状；革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阴性菌，菌体在显微镜下呈椭圆形杆状，大小为(1.2-1.8)μm
×
(3.0-5.0)μm，呈短链或者长链状排列，芽孢为椭圆形，靠近中间生长，芽孢囊微膨大。
[0017]
本发明发现苏云金杆菌zhu-64对霉菌的菌丝生长和孢子菌落产生明显的抑制作用，可以有效抑制霉菌的菌丝生长和孢子产生。
[0018]
经过试验发现本发明的苏云金杆菌zhu-64对饲料中霉菌生长有明显的抑制作用，且经过苏云金杆菌zhu-64处理的饲料不结块。
[0019]
本发明的有益效果：本发明分离的苏云金杆菌zhu-64对霉菌的菌丝生长和孢子菌落产生明显的抑制作用，经过该苏云金杆菌zhu-64处理的饲料基本无霉菌菌丝且不结块，应用于畜禽饲料的霉菌防治具有良好的抑菌效果，应用前景广阔。
附图说明
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图1为菌株对黄曲霉菌1-3菌丝生长和孢子菌落的抑制效果照片；
[0021]
图2为菌株对畜禽饲料中黄曲霉菌生长的抑制效果照片；
[0022]
图3为苏云金杆菌zhu-64遗传进化分析。
具体实施方式
[0023]
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0024]
1.苏云金杆菌分离纯化
[0025]
1.1试验样品
[0026]
从寿光生态养猪场采集猪粪及环境样品6份。
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1.2样品的处理
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对所采的新鲜样品各取1g，每个样品中加入10ml的无菌水，充分震荡得悬浮液，吸取100ul利用涂布器涂在固体na培养基平板中，37℃恒温培养24h。选取典型菌落(即菌落为圆形或者椭圆形，边缘不规则，不透明微隆起呈滴蜡状)进行纯化，获得纯培养菌株。
[0029]
1.3 16s rdna序列分析鉴定
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以提取的菌株基因组dna为模板，用细菌16s rdna引物(27f(5
[0031]
'-agagtttgatcctcctcag-3')和1492r(5'-ggatacctt gttacgactt-3'))进行扩增，pcr产物使用1.0％的琼脂糖凝胶电泳法来检测，根据marker的相对位置初步判断待测目的片段的大小，pcr扩增获得的dna片段长度750-1500bp之间。
[0032]
将扩增的pcr产物送华大基因公司进行dna序列的测定。
[0033]
将确定的碱基序列在genbank中进行blast比对。
[0034]
1.4黄曲霉菌分离纯化
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选择发霉的饲料，用无菌水冲洗3-5次晾干，用75％酒精消毒，0.1％升汞溶液表面消毒，再用无菌水冲洗，接入pda培养基，每皿4-6块，28℃恒温箱中培养观察。菌丝萌发后，选典型菌落(即菌落正面色泽随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状)转接3次，7d后用内径为0.5cm的打孔器从菌落边缘打取菌饼，转接于pda平板纯化培养，标为1-3。
[0036]
将pda平板上菌丝生长密集、菌落规则、无污染的菌株保存在1.8ml离心管中，4℃
冰箱保存。
[0037]
1.5黄曲霉菌的形态学鉴定
[0038]
菌落正面色泽随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。孢子成熟后颜色变为褐色，孢子表面平坦或有放射状沟纹，观察孢子反面无色或者褐色，在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状。制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙，则可判定其为黄曲霉菌aspergillus flavus(1-3)。
[0039]
1.6zhu-64对黄曲霉菌1-3生长抑制
[0040]
pda平板上利用十字法打孔，打四个孔，中心点到孔的距离为2.5cm。在板的中心接种黄曲霉菌1-3菌饼(0.5cm)，四个孔内接种zhu-64菌液，做3次重复试验。设置空白对照组ck，空白对照组ck在四个孔内接种无菌水。5-7d后，利用十字交叉法测量黄曲霉菌1-3菌饼的长度，并对数据进行计算分析。
[0041]
1.7zhu-64对畜禽饲料中霉菌生长的抑制
[0042]
选择饲料(成分包括：玉米63％、豆粕16％、东北ddgs(玉米干酒糟及其可溶物)6％、次粉5％、麸皮4％、东北米糠3％、预混料3％)进行处理。
[0043]
将10ml zhu-64菌添加到100g饲料中，混合均匀；添加量为10
8-109个/kg饲料。
[0044]
设置没有霉菌抑制剂和以市售丙酸钙(添加量为2g/1kg饲料)作为霉菌抑制剂作对照组，分别添加10ml水，混合均匀。
[0045]
将未经霉菌抑制剂处理、经霉菌抑制剂(丙酸钙)处理及经zhu-64处理的饲料先暴露空气中24h，然后将饲料放入塑料瓶中密封，温度40℃培养。每间隔1d称取1g饲料，无菌水稀释10000倍，利用血球计数板计数。
[0046]
2结果与分析
[0047]
2.1 16s rdna序列分析鉴定
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从猪场分离获得一株细菌，16s rdna序列pcr反应后测序。测序结果在genbank中进行blast比对。
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比对后选取与zhu-64同源性最接近的其他芽孢杆菌基因序列(bacillus thuringiensis:mg709181.1、ku898281.1；bacillus toyonensis:on933850.1、on933868.1)建立进化树，并分析。参见图3,zhu-64与bacillus thuringiensis:mg709181.1相比同源性》99％，可以鉴定该菌株为苏云金杆菌(bacillus thuringiensis)，将其命名为苏云金杆菌zhu-64，并将该菌株于2022年07月25日送交位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为cctccno：m20221173。
[0050]
2.2苏云金杆菌zhu-64对黄曲霉菌1-3生长抑制
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表1zhu-64对黄曲霉菌1-3生长抑制
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采用十字交叉法测定苏云金杆菌zhu-64对峙培养的黄曲霉菌1-3生长，结果如表1和图1，从上表1的结果可以看到，对峙培养的黄曲霉菌1-3接种菌饼菌落直径明显较对照组的小。苏云金杆菌zhu-64对黄曲霉菌1-3的抑菌率达60％，抑菌效果显著。参见图1，对峙培养黄曲霉菌1-3基本无散落菌落。zhu-64对黄曲霉菌1-3散落菌落抑制率达100％，可见，本发明的苏云金杆菌zhu-64可以有效抑制黄曲霉菌的菌丝生长和孢子产生。
[0054]
2.3苏云金杆菌zhu-64对畜禽饲料中霉菌生长的抑制
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(1)苏云金杆菌zhu-64对畜禽饲料中霉菌孢子数量的影响
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采用血球计数法记录上述1.7中霉菌孢子个数。
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参见表2，通过试验发现，经过苏云金杆菌zhu-64处理后，饲料的霉菌孢子数量明显减少，孢子抑制率在29％-58％之间。相比丙酸钙霉菌抑制剂的抑制率高16％以上，可见，苏云金杆菌zhu-64对霉菌孢子生长的抑制效果较好，可以应用于畜禽饲料的霉菌防治中。
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表2zhu-64对饲料中霉菌孢子生长抑制
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(2)苏云金杆菌zhu-64对畜禽饲料中霉菌生长的影响
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参见图2，图中从左至右依次为空白对照组、市售霉菌抑制剂处理组和苏云金杆菌zhu-64处理组的测试结果。实验处理30d后，观察饲料中霉菌生长情况，可以看到，左一空白对照处理饲料(未添加抑菌剂)和左二市售霉菌抑制剂(丙酸钙)处理饲料的霉菌增长迅速，覆盖饲料表面，且饲料有结块。而右一经苏云金杆菌zhu-64处理的饲料基本无霉菌菌丝且不结块。
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由此可见，本发明的苏云金杆菌zhu-64主要通过抑制霉菌的菌丝和孢子生长从而抑制霉毒毒素的产生，能有效抑制霉菌菌丝和孢子的生长，持久抑制效果较好，比市面上的常用的霉菌抑制剂丙酸钙的抑制效果更好，而且苏云金杆菌zhu-64对饲料的影响很小，不会造成饲料结块等现象，苏云金杆菌zhu-64作为畜禽饲料霉菌防治用的霉菌抑制剂有良好的应用前景。
[0063]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。