一种外泌体的制备方法与流程

1.本发明涉及一种外泌体的制备方法，具体涉及一种从细胞上清液中分离、纯化外泌体的方法。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vehicles，evs)是由古细菌、细菌和真核生物的大多数细胞分泌的微小膜泡。细胞外囊泡的大小为纳米级别，具有双层封闭膜结构，其包含脂质、rna、代谢物、生长因子和细胞因子等成分。细胞外囊泡能够调节复杂的细胞通讯，维持生物体的正常生理或引发严重的疾病。根据细胞外囊泡的生物发生和分泌机制，通常将细胞外囊泡分为三种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体，其中外泌体的生物发生和分泌机制是细胞质膜向内出芽并随后形成多囊泡体，多囊泡体与细胞质膜融合，分泌到胞外，形成粒径在30-200nm的膜性囊泡。
3.随着靶向药物递送领域的发展，纳米药物载体得到越来越多的关注。外泌体作为一种天然来源的递送载体，具有免疫原性低、毒副作用小、对受体细胞有一定的选择性、与核酸分子亲和性高、能够透过血脑屏障等优点，因此众多生物医药公司投入外泌体载药平台的开发中，而获得高质量的外泌体是外泌体载药的先决条件。
4.外泌体的提取技术主要包括超速离心法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法、免疫捕获法等。超速离心根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离；密度梯度离心法利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离；化学沉淀法通过聚乙二醇(peg)等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出；尺寸排阻法是根据外泌体大小利用色谱柱进行分离提取的方法。虽然已经开发了上述多种外泌体提取技术，但是在实际的制备中，这些方法很难同时兼顾外泌体的质量和收率。保证质量，例如提高纯度和外泌体结构稳定性，则无法提高收率，导致外泌体的生产成本和使用成本高，生产效率低；保证收率，则外泌体的纯度、外泌体膜结构的完整性、外泌体的天然活性等质量下降，例如外泌体提取物中常常无法避免含有细胞残留的蛋白、核酸、或者细胞产生的其它结构的囊泡，对外泌体的功能性发挥带来极大的影响，限制了外泌体载药系统的开发。
5.专利cn111321108a公开了一种外泌体分离方法，其采用了peg6000沉淀，透析和碘克沙醇密度离心共同处理外泌体，虽然缩短了处理时间，但是从其透射电镜结果看来，外泌体的“杯盘”结构不明显，外泌体存在变形，且电镜图中仅含一个外泌体，可知其提高纯度的同时牺牲了收率。
6.专利cn1109646694a公开了一种外泌体的提取方法，其基于密度梯度离心和超速离心来提高外泌体的纯度和收率，但是从其透射电镜图看来，外泌体的“杯盘”结构不明显，外泌体存在变形，虽然视野中存在多个外泌体，但是背景嘈杂，说明提取物中杂质较多，其外泌体质量有待提高。
7.纵观现有技术，始终缺乏能够同时兼顾外泌体的质量和收率的制备方法。对于外
泌体的载药功能研究来说，如何改进外泌体的制备方法，获得高质量、高收率的外泌体是亟待解决的问题。


技术实现要素：

8.本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的外泌体的制备方法。
9.为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
10.一种外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
11.1)采用切向流过滤方法浓缩细胞上清液得到浓缩液，其中采用截留分子量为100kda～750kda的中空纤维柱来进行切向流浓缩，且浓缩倍数为10～20倍；
12.2)采用全能核酸酶对所述浓缩液进行去核酸处理并经重悬得到粗提液；
13.3)对所述粗提液进行密度梯度离心，收集外泌体层；
14.4)在离心力小于等于50000g的条件下对所述外泌体层进行低速离心，去除沉淀得到初步纯化液；
15.5)在离心力大于等于100000g的条件下对所述初步纯化液进行超速离心，所得沉淀即为所述外泌体。
16.优选地，步骤1)中，所述切向流过滤方法采用截留分子量为100kda～500kda的中空纤维柱，进一步地，可选择100kda或200kda或300kda或500kda的中空纤维柱。
17.优选地，步骤1)中，所述浓缩的倍数为10倍、12倍、14倍、16倍、18倍或20倍。
18.优选地，步骤2)中，向所述浓缩液中加入全能核酸酶和水溶性金属盐，控制温度25℃～37℃，使浓缩液中的核酸裂解，之后在离心力为100000g～200000g的条件下进行超速离心，收集沉淀并使用缓冲液溶解，得到所述粗提液。
19.进一步优选地，步骤2)中使用的水溶性金属盐包括但不限于水溶性镁盐、水溶性钙盐、水溶性锰盐。更进一步优选水溶性金属盐为氯化镁、氯化钙或氯化锰中的一种或多种。
20.具体地，采用水浴的方式控制温度。
21.具体地，用于溶解沉淀的缓冲液为pbs缓冲液、tris缓冲液或hepes缓冲液，优选为pbs缓冲液。
22.优选地，步骤3)中，采用碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液作为梯度介质，先加入到离心管中，将所述粗提液与碘克沙醇溶液预混，加入到梯度介质底部，最后用封存液填满离心管，在离心力为100000g～200000g的条件下进行离心，收集外泌体层。
23.根据一些具体实施方式，在向所述离心管中加入所述碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液之前，加入封存液。
24.根据一些具体实施方式，所述碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液由碘克沙醇溶液与蔗糖缓冲液按照体积比为1∶(4～6)混合而成，其中碘克沙醇溶液的质量浓度为55％～65％，所述蔗糖缓冲液的ph值为7.0～7.5并且包含有蔗糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris hcl)和乙二胺四乙酸(edta)，其中蔗糖的浓度为200mm～300mm。
25.根据一些具体实施方式，所述预混时，将质量浓度为55％～65％的碘克沙醇溶液与所述粗提液按照体积比为1∶(1～3)进行混合。
26.根据一些具体实施方式，所述封存液为pbs缓冲液、tris缓冲液或hepes缓冲液或它们的任意组合。
27.离心后，外泌体层为迁移至封存液与梯度介质之间的白色界面层。
28.本发明中，通过优化的前期处理，使得密度梯度离心时所需的层次更少，操作更加方便。
29.根据一些具体实施方式，所述蔗糖缓冲液的组分包括200mm～300mm的蔗糖、5mm～15mm的tris hcl、0.5mm～1.5mm的edta。
30.优选地，步骤4)中采用的离心力为20000g～50000g。通过采用适当的离心力，既能有效去除外泌体梯度层中残留的蛋白质，又能避免外泌体析出。
31.优选地，步骤5)中采用的离心力为100000g～200000g，进一步优选在离心力为100000g～150000g的条件下离心。
32.本发明中，收集的外泌体沉淀使用pbs缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或无菌无酶水重悬后保存，后期可直接使用。
33.本发明中，所述制备方法中所有的离心均在0℃～8℃下进行。
34.根据一些具有实施方式，所述制备方法具体如下：
35.(1)采用截留分子量为100kda～750kda的切向流过滤方法将细胞上清液浓缩10～20倍，得到浓缩液；
36.(2)向所述浓缩液中加入全能核酸酶和水溶性金属盐，控制温度25℃～37℃，使浓缩液中的核酸裂解，之后在离心力为100000g～200000g的条件下进行超速离心，收集沉淀并使用缓冲液溶解，得到所述粗提液；
37.(3)在向所述离心管中加入封存液，采用碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液作为梯度介质，从封存液底部加入到离心管中，之后将预混好的粗提液与碘克沙醇溶液加入到梯度介质底部，最后用封存液填满离心管，在离心力为100000g～200000g的条件下进行离心，离心结束后，收集封存液层与梯度介质层之间的白色界面层，得到外泌体层；
38.(4)在离心力为20000g～50000g的条件下对所述外泌体层进行低速离心，去除沉淀得到初步纯化液；
39.(5)在离心力为100000g～200000g的条件下对所述初步纯化液进行超速离心，所得沉淀即为所述外泌体。
40.优选地，步骤2)中使用的水溶性金属盐包括但不限于水溶性镁盐、水溶性钙盐、水溶性锰盐。
41.更具体地，步骤(2)中，所述水溶性金属盐为氯化镁、氯化钙或氯化锰中的一种或多种，其在体系中的浓度为0.5mm～2mm，例如0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm。
42.更具体地，步骤(2)中，所述全能核酸酶在体系中的终浓度为15u/ml～25u/ml，例如15u/ml、18u/ml、20u/ml、22u/ml、24u/ml、25u/ml。
43.更具体地，步骤(2)中，所述核酸裂解的时间为3h～16h。根据一些具体实施方式，温度为25℃～32℃，核酸裂解的时间为8～16h。根据另一些具体实施方式，温度为32℃～37℃，核酸裂解的时间为3h～8h。
44.更具体地，步骤(3)中，所述密度梯度离心的时间为15h～20h；
45.更具体地，步骤(4)中，所述低速离心的时间为20min～40min；
46.更具体地，步骤(5)中，所述超速离心的时间为2h～5h。
47.更具体地，步骤(6)中收集的沉淀使用pbs缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或无菌无酶水重悬后保存。
48.优选地，在所述浓缩之前，先对所述细胞上清液进行两级微滤处理，其中第一级微滤采用的滤膜孔径为0.3μm～0.5μm，第二级微滤采用的滤膜的孔径为0.2μm～0.25μm。
49.进一步优选地，在所述两级微滤处理之前可先采用深层过滤膜包去除部分残留的细胞、细胞碎片和其他颗粒较大的杂质，可减轻两级过滤的压力，防止两级微滤处理时出现堵塞现象。
50.优选地，所述细胞上清液由细胞密度大于9
×
106个/ml，细胞活力大于90％的细胞培养液经多级离心得到，所述多级离心包括第一级离心和第二级离心，所述第一级离心的离心力小于10000g，所述第二级离心的离心力为10000g～50000g。
51.本发明中，所述细胞没有特别限制，可以是人胚肾细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞、肝细胞、免疫细胞、基质细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、红细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞中的一种或多种。
52.在一个优选实施方式中，所述细胞为人胚肾细胞。
53.本发明还提供由上述外泌体的制备方法制备得到的外泌体以及上述外泌体在药物递送系统中的应用。
54.由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：
55.本发明方法获得的外泌体，其膜结构完整、不变形，纯度、颗粒浓度以及外泌体标志蛋白阳性率更高，相比现有方法制备的外泌体质量更好，同时本发明方法步骤简单、收率高、成本低。
附图说明
56.图1为实施例1制备的外泌体的透射电镜图；
57.图2为对比例1制备的外泌体的透射电镜图；
58.图3为实施例1制备的外泌体的粒径分布图；
59.图4为对比例1制备的外泌体的粒径分布图；
60.图5为实施例1制备的外泌体的表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率检测结果图；
61.图6为对比例1制备的外泌体的表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率检测结果图；
62.图7为实施例1和对比例1制备的外泌体的蛋白表达的凝胶电泳图。
具体实施方式
63.以外泌体作为药物体内递送系统是目前靶向药物研究的重点之一。虽然目前已有多种从细胞培养液中提取外泌体的方法，但是如何获得高质量和高收率的外泌体一直是本领域的难点。不管是在实验室的少量制备，还是在工业化中的大批量制备中，均很难同时兼顾外泌体的质量和收率。分析其原因，主要由于细胞培养液中存在宿主细胞残留的蛋白、核酸，以及细胞产生的其它囊泡结构，在外泌体的提取过程中，需要尽量去除这些物质，而外泌体为囊泡结构，在制备过程中已变形、破碎，天然活性大大下降，不合理的制备流程或不
合适的步骤参数，都会对外泌体的质量造成影响。在制备过程中，实验人员无法确认每一步操作对提取液中外泌体的质量、收率的直接影响，也就无法随时进行调整，在制备结束后，实验人员也无法根据外泌体的质量分析确认制备方法中的哪些细节需要调整以及如何调整，这也是外泌体的研究困难的原因。因此，始终没有开发出能够获得高质量和高收率的外泌体的制备方法。本发明旨在解决前述问题。
64.本发明通过对工艺进行整体设计，包括不同工艺之间的有机组合，步骤流程设计，对于保证后续制备的外泌体的纯度和收率以及天然生物活性起到了出乎意料的积极作用。本发明进一步对制备条件参数进行优化，制备的外泌体结构完整不变形，纯度高，天然活性高且收率高。本发明方法有助于实现外泌体的工业化制备，为以外泌体为载体的靶向药递送研究提供有力的支撑。
65.术语定义
66.术语“外泌体”和“evs”可以互换，包括由内体、溶酶体和/或内溶酶体途径衍生的囊泡，涉及未经任何修饰的天然外泌体、基因修饰/基因工程化改造外泌体。
67.当描述术语“外泌体”时，通常指的不是一个外泌体，而是多个外泌体的群体，通常以每单位体积(如每毫升)中外泌体的数量(颗粒数)来表示其浓度。
68.术语“基因修饰/基因工程化改造外泌体”是指由基因修饰/工程化改造细胞衍生而来的外泌体，该类外泌体中通常包含重组或外源性dna或其蛋白产物。
69.术语“培养细胞”是指在适当条件下扩大可产生ev的任何细胞的数量或浓度，例如，在悬浮培养或贴壁培养或任何其他类型的培养系统中。
70.术语“可产生ev的任何细胞”包括但不限于所述细胞为人胚肾细胞、间充质干细胞、基质细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、红细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞中的一种或多种等。
71.术语“药物递送系统”指递送药物活性成分至期望的身体部位和/或使治疗剂适时释放的制剂。本技术中，细胞来源外泌体可递送的药物活性成分包括小分子药物或生物治疗剂，所述的生物治疗剂不天然存在于细胞来源外泌体中，所述的生物治疗剂选自肽、蛋白质、多糖或核酸，所述的核酸选自单链或双链dna、irna、sirna、shrna、mrna、非编码rna(ncrna)、反义rna、lna、吗啉代寡核苷酸或其类似物或缀合物。
72.术语“无血清培养基”是指任何不含异源或同源血清的细胞培养基，并且本领域己知的任何细胞培养基均可使用，只要它不含血清。
73.术语“分离纯化”是指包含感兴趣的分析物的试验样品和干扰物质彼此物理隔离或分开。
74.术语“离心力”是指将旋转体拉离旋转中心的表观向外力。所述方法优选地为机械方法，更优选地通过在旋转装置诸如离心机中施加离心力来进行。
75.术语“膜”表示半渗透材料，其可以用于将供给流体中的组分分离成穿过材料的渗透物和被材料截留的保留物。
76.术语“密度梯度离心(density gradient centrifugation)”指用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将包含感兴趣的分析物的试验样品与底层混合，通过离心力场的作用使感兴趣的分析物分层、分离。
77.术语“切向流浓缩(tff)系统”和“交叉流过滤”可以互换，指从流体混合物分离悬
浮粒子，包括从流体混合物非均匀粒子混合物中分离具有确定特征(例如要求的粒度范围)的粒子，并对流体进行浓缩。
78.术语“全能核酸”和“广谱核酸酶”可以互换，是一种来源于粘质沙雷氏菌(serratia marcescen)的非特异性核酸内切酶，可在非常宽泛的条件下、切割链内任意核苷酸，将核酸(含单链、双链、线状、环状、天然或变性等多种形式的dna和rna)完全消化成2～5个碱基长度的5
’‑
单磷酸寡核苷酸。
79.下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下实施例和对比例仅以人胚肾细胞为例，其他细胞，例如成纤维细胞、间充质干细胞或基质细胞等，同样适用于上述制备方法，针对不同的细胞，部分步骤中的参数可进行适当的调整。
80.本发明中，如无特殊说明，使用的仪器、原料和试剂均可通过商购获得，实验技术和检测方法为本领域常规技术手段。本发明中，使用的离心机为低温离心机。深层过滤时使用的膜包可选择德国merck、美国pall、美国cytiva、德国赛多利斯、美国3m等公司商售产品。以下实施例和对比例中使用的是杭州科百特公司的货号为csccd1070pcp的膜包，能够有效拦截部分细胞、细胞碎片和其他颗粒较大的杂质。
81.实施例1
82.本实施例提供一种外泌体的制备方法，其具体步骤如下：
83.[1]37℃、8％co2、120rpm水平摇床(振幅19mm)培养条件下，采用无血清培养基培养hek293f细胞至活细胞密度大于9
×
106个/ml，细胞活力大于90％。
[0084]
[2]收集培养液1000ml(细胞和上清)，6000g，4℃离心20min，收集上清a。
[0085]
[3]上清a 16000g，4℃离心30min，收集上清b。
[0086]
[4]通过深层过滤得到上清c。
[0087]
[5]上清c依次经0.45μm滤膜和0.22μm滤膜过滤，收集上清d。
[0088]
[6]上清d经300kda中空纤维柱进行切向流过滤浓缩15倍，得到浓缩液。
[0089]
[7]向浓缩液中加入mgcl2溶液(终浓度1mm)和全能核酸酶(终浓度20u/ml)，25℃水浴16h或37℃水浴3h。
[0090]
[8]水浴结束后的浓缩液133900g，4℃离心60min，用3.25ml pbs将沉淀重悬，用1ml的注射器反复吹打直到沉淀全部溶解，得到粗提液3.25ml。
[0091]
[9]配制蔗糖(sucrose)缓冲液(250mm sucrose、10mm tris hcl、1mm edta，ph 7.4)，将蔗糖缓冲液和质量浓度为60％(w/v)的碘克沙醇(iodixanol)溶液，配制17.5％(v/v)(iodixanol溶液/(iodixanol溶液+sucrose缓冲液))的第一混合液作为梯度介质。将粗提液和质量浓度为60％的碘克沙醇(iodixanol)溶液预混，配成45％(v/v)(iodixanol溶液/(iodixanol溶液+粗提液))的第二混合液，以pbs作为封存液。用进样针将约6ml的pbs加到体积约39ml的离心管底部，再用进样针依次将第一混合液和第二混合液从离心管最底部加入，最后从液面上方用pbs补满管。同时设置不加粗提溶液的空白对照组。
[0092]
[10]150000g、4℃离心16h，收集迁移至pbs和第一分层液之间的白色界面层，即为外泌体层。
[0093]
[11]外泌体层转移到39ml新管中，用pbs补满管，在20000g、4℃下离心30min，去除
沉淀，沉淀主要为残留的蛋白，收集上清e约39ml，即为初步纯化液。
[0094]
[12]将上清e转移到新管中，135000g、4℃离心3h，沉淀即为外泌体。
[0095]
[13]将沉淀用200μl pbs重悬，4℃保存。
[0096]
实施例2
[0097]
本实施例提供一种外泌体的制备方法，其基本同实施例1，不同的是，对细胞上清进行浓缩时采用100kda中空纤维柱。
[0098]
实施例3
[0099]
本实施例提供一种外泌体的制备方法，其基本同实施例1，不同的是，对细胞上清进行浓缩时采用500kda中空纤维柱。
[0100]
对比例1
[0101]
本对比例提供一种外泌体的制备方法，与实施例1大致相同，与实施例1不同的是，未进行步骤[4]～[6]。
[0102]
外泌体鉴定实验
[0103]
通过透射电子显微镜(tem)观察所提取的外泌体膜结构是否完整、大小是否符合预期；通过不同检测指标对所提取的外泌体进行鉴定，通过纳米颗粒跟踪技术(nta)对外泌体的粒径和颗粒数浓度进行分析，颗粒数浓度越低说明外泌体收率越低；通过nanofcm纳米流式检测仪检测fitc抗体标记的外泌体的表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率，确定外泌体纯度；western blot实验确定外泌体的标志蛋白的表达情况；bca法检测切向流浓缩前后蛋白浓度，根据蛋白浓度和切向流浓缩前后体积，计算浓缩液中杂质蛋白的去除率。
[0104]
通过透射电子显微镜(tem)观察实施例、对比例最终获得的外泌体情况，在形同放大倍数下，相同视野内，实施例中外泌体中膜结构完整且无变形的呈“杯盘”结构的典型囊泡数量更多，背景杂质更少。对比图1和图2可见，实施例1制备的外泌体膜结构完整、无变形，大小符合预期，典型囊泡数量更多，背景杂质明显更少；对比例1制备的外泌体中典型囊泡数量明显减少，背景杂质明显更多。在实施例1～实施例3这三个实施例中，背景杂质均很少，但实施例1和实施例2制备的外泌体的典型囊泡数量明显多于实施例3。
[0105]
通过纳米颗粒跟踪技术(nta)对实施例和对比例的外泌体的颗粒粒径和颗粒数浓度进行分析，结果如图3和图4所示：实施例1的外泌体的粒径分布窄，峰值粒径142.4nm，平均粒径为173.1nm，均一性好，外泌体的颗粒数浓度为1.01e+12(颗粒数/ml)，对比例1的外泌体的颗粒数浓度为1.41e+11(颗粒数/ml)，对比例1的外泌体收率明显低于实施例1。
[0106]
根据nanofcm比较实施例和对比例的外泌体表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率，实施例制备的外泌体的表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率的阳性率均高于对比例。根据图5和图6显示，实施例1的外泌体的表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率分别为：26.2％、31.2％和42.9％，对比例1的外泌体的表面蛋白cd9、cd63和cd81的阳性率分别为：22.1％、22.7％和35.5％，实施例1的外泌体纯度明显高于对比例1。
[0107]
根据western blot比较实验例与对比例的外泌体的标志蛋白的表达情况，进一步确定并比较实施例和对比例的外泌体。图7显示，实施例1的外泌体的标志蛋白cd9的表达量明显高于对比例1外泌体的cd9的蛋白表达量，其他标志蛋白表达量相差不大(实施例1的tsg101和cd81蛋白表达量略高于对比例1)，说明实施例1和对比例1获得的囊泡颗粒确实为外泌体。cd63的表达成弥散状，而对比例1的cd63表达相比实施例1弥散程度更高，说明其纯
度比实施例1低。采用纳米颗粒跟踪技术(nta)分别检测实施例1、实施例2和实施例3在切向流浓缩阶段，过膜前(上清d)的颗粒数浓度和过膜后(浓缩液)的颗粒数浓度，结合过膜前(上清d)的体积和过膜后(浓缩液)的体积，计算切向流浓缩阶段囊泡回收率，囊泡回收率(％)＝(过膜后的颗粒数浓度
×
过膜后的体积)
÷
(过膜前的颗粒数浓度
×
过膜前的体积)
×
100％；根据bca法分别检测实施例1实施例2和实施例3在切向流浓缩阶段，过膜前(上清d)的蛋白浓度和过膜后(浓缩液)的蛋白浓度，结合过膜前(上清d)的体积和过膜后(浓缩液)的体积，计算杂质蛋白去除率，杂质蛋白去除率(％)＝(过膜后的蛋白浓度
×
过膜后的体积)
÷
(过膜前的蛋白浓度
×
过膜前的体积)
×
100％。囊泡回收率(％)和杂质蛋白去除率(％)结果分别见表1。
[0108]
表1
[0109]
切向流浓缩前后囊泡回收率(％)杂质蛋白去除率(％)100kda中空纤维柱116.6798.67300kda中空纤维柱57.2199.84500kda中空纤维柱57.66100
[0110]
表1显示，500kda中空纤维柱和300kda中空纤维柱对蛋白的去除率分别达到100％和99.84％，可知截留分子量小于等于500kda的中空纤维柱均可有效去除上清d中的杂质蛋白。100kda中空纤维柱和300kda中空纤维柱对囊泡的回收效率分别为78.26％和85.71％。随截留分子量的减小，过膜后的浓缩液中的其它杂质分子含量增加，对后续提取纯化步骤带来压力，随截留分子量的增大，囊泡回收率下降，导致最终外泌体收率下降，因此综合多方面因素，在切向流浓缩步骤优选截留分子量为100kda-500kda的中空纤维柱。
[0111]
以上对本发明做了详尽的描述，目的在于让本领域内的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。