一株三氯乙烯降解菌及其应用的制作方法

1.本发明属于生物工程领域，提供了一株三氯乙烯降解菌及其应用。


背景技术：

2.三氯乙烯(tce)是一种常用的化工原料，但由于不合理的处置和排放已成为环境水体中常见的有机污染物之一。其具有潜在致癌、致畸、致突变毒性，对生态环境和人体造成极大威胁。大气环境中，tce在一周时间内会被降解掉，但是由于tce具有很强的吸附特性及稳定性，在土壤中半衰期约0.5-1.5年；在地下水中半衰期约为1-4.5年。大气环境和地表水环境之间的tce转换主要依赖土壤进入地下水主体，因此tce一旦进入土壤和地下水环境，便会引起大面积的长期污染。所以及时有效的减少地上环境中tce的污染显得尤为重要。
3.物化法、化学法、生物法均可去除tce。物化法中应用较多的如吸附法、膜分离法、吹脱等方法成本昂贵，且只将污染物转移，而不能使它变成无害产物，容易造成二次污染。化学法中目前研究较多的有tio2光催化法、零价铁还原法、双金属还原法。化学法相对而言成本昂贵，人们一直在寻找更加经济有效的方法。通过微生物作用将tce转化为无毒物质，经济有效且无二次污染，近年来成为研究的热点。
4.微生物是tce生物降解过程的主体，微生物对污染物质的代谢是微生物降解过程的核心。生物法因其具有处理效率高、降解彻底等无二次污染等优点，被广泛应用在难降解有机物修复治理工程中。tce毕竟是一种毒性很强的有机物，多数实验证明，高浓度的tce对微生物毒性很强，针对三氯乙烯降解菌的研究中绝大多数的好氧菌是以好氧-共代谢进行降解的，生长基质即第一基质作为电子供体，微生物以第一基质作为碳源和能源对非生长基质(三氯乙烯)进行转化，目前分离出的tce直接降解菌数目很有限，污染场地环境复杂，单纯的依赖tce直接降解菌并不能实现tce的有效去除。
5.因此，分离和选育具有高耐受能力和降解能力的菌株应用于tce的生物修复及生物强化技术显得尤其重要。


技术实现要素：

6.针对现有技术问题，本发明所述目的在于提供一种对环境适应性强的三氯乙烯降解菌，以解决三氯乙烯可生化性差难降解的问题。
7.首先，本发明所述的三氯乙烯降解菌从石化污水厂的污水处理系统中采集样品，经过富集，在以三氯乙烯为唯一碳源的无机盐培养基中，再进一步梯度富集、分离纯化得到。同时进一步进行fujiwara test实验，确认该菌可以以三氯乙烯为唯一的碳源进行生长。
8.本发明所述三氯乙烯降解菌为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24319。
9.该枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，菌落表面有褶皱粗糙不透明,菌落为白色或微
黄色，边缘不规则，挑起拉丝。
10.本发明另一目的在于保护该枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)在三氯乙烯降解方面的应用。具体应用范围包括含三氯乙烯的废水、废气、土壤的生物强化处理。
11.具体应用方法为：将该枯草芽孢杆菌或其菌剂投入到处理系统中，可以有效耐受三氯乙烯类污染物的冲击，能够利用生化系统中的有机物作为自身生长的营养物质，快速降解有机物。优选的，保证处理系统初始枯草芽孢杆菌有效活菌数为1～8
×
107cfu/ml，能够使菌株迅速适应环境，以三氯乙烯为碳源进行代谢生长，有效发挥菌株的三氯乙烯降解效果。
12.更进一步的，本发明所述三氯乙烯降解菌可在三氯乙烯污水中连续培养应用，降解效果稳定。
13.作为进一步方案，本发明提供了该三氯乙烯降解菌的菌剂，通过发酵制备而成：
14.发酵培养基按质量百分比计为：豆粕5.5-6.5％，玉米淀粉6-6.5％，葡萄糖0.3-0.5％，碳酸钙0.3-0.5％，玉米浆干粉0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，硫酸镁0.05-0.15％，氯化钠0.1-0.2％，硫酸锰0.01-0.03％，水余量，ph7-7.5。高压灭菌121℃，30min后使用。
15.所述三氯乙烯降解菌在30-37℃的条件下进行高密度发酵培养48-72h，待发酵结束，得到液体菌剂，菌剂的有效活菌数为5
×
108～2
×
10
10
cfu/ml。还可以进一步制备成固体菌剂等，制备方法采用常规技术即可。
16.更进一步的，发酵温度为33
±
1℃，溶氧30％左右，培养48-72h，溶氧上升，ph下降，停止发酵。
17.优选的，上述获得的液体菌剂应用于含三氯乙烯的处理系统中，菌剂添加量(按体积算)为生化系统体积的1
‰‑5‰
，优选的，生化系统条件为温度25-38℃，ph6.0-8.0，溶氧≥2mg/l。
18.优选的，生化系统中三氯乙烯初始浓度在900mg/l以下，更优选的，生化系统中三氯乙烯初始浓度在300mg/l以下；最优选的，生化系统中三氯乙烯初始浓度在150mg/l以下。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.本发明提供一种可直接以三氯乙烯为唯一碳源的降解菌，其在利用三氯乙烯为唯一的碳源和能源的条件下，可快速降解三氯乙烯，在应用中具有简单、高效的特点，同时菌株对三氯乙烯的毒性耐受能力强，对温度、ph等条件的适应范围广，在工业废水、废气的生物净化中具有很好的应用前景。
21.保藏信息
22.保藏时间：2022年1月17日；
23.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
24.保藏编号：cgmcc no.24319；
25.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
26.分类命名:枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
附图说明
27.图1实施例4中不同温度下枯草芽孢杆菌yjy22-10对三氯乙烯的生物降解对比图；
28.图2实施例4中不同ph条件下枯草芽孢杆菌yjy22-10对三氯乙烯的生物降解对比图；
29.图3实施例4中枯草芽孢杆菌yjy22-10对不同初始浓度三氯乙烯的降解对比图。
具体实施方式
30.以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
31.以下实施例中所涉及的菌剂发酵过程的“溶氧”是指空气饱和度(％)，是发酵行业通用的溶解氧浓度的表示方法。
32.以下实施例中所涉及的污水处理的曝气过程的“溶氧”是指水中溶解氧的绝对浓度，以mg/l表示，是环保行业污水处理常用溶氧表示方法。
33.实施例1三氯乙烯降解菌的富集、筛选与分离
34.取某石化及农化的污水处理厂区污水处理系统附近污泥进行富集与筛选处理，采用逐步提高三氯乙烯浓度的方法对三氯乙烯降解菌进行富集。
35.具体的操作方法为：取活性污泥样品10ml，接种于100ml富集培养基(三氯乙烯初始浓度为10mg/l)中，30℃160r/min摇床振荡培养2-5d进行富集培养，取样检测系统三氯乙烯的含量，待其降解至低于1mg/l时，取出10ml菌液接种到新鲜的100ml无机盐培养基中(三氯乙烯浓度为20mg/l)，重复上述步骤，以50、75、100、125、150、200mg/l为梯度，逐步提高培养基中三氯乙烯的浓度至500mg/l。
36.将最后的富集培养液经梯度稀释后涂布于三氯乙烯为唯一碳源的无机盐培养基平板上，于30℃培养箱中培养2-3d。将平板上长出的形态不同的单菌落分别划线于无机盐培养基平板纯化至少3次，纯化后挑取单菌落接种于10ml的lb液体培养基中，次日以2％(v/v)的接种量分别接种于含有50mg/l三氯乙烯的100ml无机盐液体培养基中，30℃、160r/min培养24h，之后取样采用气相色谱检测三氯乙烯的含量。
37.由此方法分离得到10株菌，其中编号为45的菌可以在24h内将100mg/l的三氯乙烯完全降解，将其进行保存。
38.为了进一步验证分离的菌种是以三氯乙烯为唯一的碳源和能源进行生长代谢，进行了fujiwara test实验，该实验用于检测体系中游离多氯烃的浓度。在碱性环境中用吡啶处理tce，然后通过分光光度法在470nm测定水相的吸光度，当形成粉色说明为fujiwara test阳性。
39.无机盐培养基中三氯乙烯含量为100mg/l，实验组以2％(v/v)接种筛选到的编号为45的菌，对照组加入相应含量的无菌水，30℃、160r/min培养24h后，取样进行检测，实验组处理后检测水相无粉红色，对照组呈粉红色，说明为阳性。该实验说明该菌可以将三氯乙烯作为唯一的碳源进行生长代谢。
40.上述无机盐培养基每1l含以下组分：k2hpo
4 1g，kh2po
4 1g，nacl 0.5g，nh4cl 1g，mgso4·
7h2o 0.2g，cacl
2 15mg，feso4·
7h2o 2mg，cuso4·
5h2o 0.4mg，ki 1mg，mnso4·
h2o 4mg，h3bo
3 5mg，cocl2·
6h2o 1mg，na2moo4·
2h2o 2mg，nicl2·
6h2o2mg，ph 7.0
±
0.2，灭菌使用，ph自然，使用蒸馏水配制，121℃，20min灭菌，固体培养基添加琼脂20g，使用前添加三
氯乙烯。
41.上述固体培养基中三氯乙烯的添加，在培养皿的盖上贴一张无菌滤纸，将三氯乙烯滴于滤纸片上，利用三氯乙烯的蒸汽进行菌体培养。
42.上述富集培养基按照蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，加水至1.0l配制，调节ph值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌20min。
43.实施例2三氯乙烯降解菌的菌种鉴定及菌落特征
44.菌种鉴定：对实施例1中得到的编号为45的三氯乙烯降解菌进行16s rdna鉴定，ncbi数据库比对该16s rdna序列，在分子水平上鉴定结果该菌属于枯草芽孢杆菌，其16s rdna的核苷酸序列如序列表中seq id所示。
45.上述三氯乙烯降解菌枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，菌落表面有褶皱粗糙不透明,菌落为白色或微黄色,边缘不规则，挑起拉丝。将其命名为yjy22-10，并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为cgmcc no.24319
46.实施例3三氯乙烯降解菌剂制备
47.利用本发明菌株制备三氯乙烯降解菌剂，具体制备方法如下：
48.第一步，将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃-25℃)活化4h-8h，活化时无需额外补加培养基；
49.第二步，将第一步的得到的单菌落接种至lb液体培养基(100ml)内，于35℃，185r/min的条件下过夜培养，得到一级种子液，将得到的一级种子液按照10％(v/v)接种至lb培养基中，同样条件下培养16h，获得二级种子液，并置于4℃保存；
50.第三步，将第二步得到的二级种子液按照1
‰
(v/v)接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制发酵温度为33
±
1℃，溶氧30％左右，培养20-30h，溶氧上升，ph下降，停止发酵即得到三氯乙烯降解菌剂。
51.在本实施例中所得三氯乙烯降解菌剂的活菌数为1.3
×
10
10
cfu/ml。
52.上述发酵培养基按质量百分比计为：豆粕6％，玉米淀粉6％，葡萄糖0.5％，碳酸钙0.3％，玉米浆干粉0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.1％，硫酸锰0.02％，聚醚消泡剂0.1％，ph7-7.5；高压灭菌121℃，30min后使用。
53.上述lb培养基由蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，加水至1.0l配制，调节ph值至7.0，121℃灭菌20min后使用。
54.实施例4三氯乙烯降解菌降解特性的检测
55.将实施例3中得到的三氯乙烯降解菌剂2ml接种至50ml无机盐培养基中，其中以三氯乙烯为唯一的碳源和能源，进行降解能力的检测。为减少三氯乙烯的挥发，同时也保证菌种的溶氧量，以下降解实验均在250ml磨砂口的玻璃瓶中进行。
56.1、不同温度下枯草芽孢杆菌yjy22-10对三氯乙烯的生物降解特性
57.不同温度下枯草芽孢杆菌yjy22-10对三氯乙烯的生物降解特性实验发现其在30℃以上时对三氯乙烯具有较好的降解能力，从实际应用来看其在33℃时的降解能力最佳，具体实施步骤如下：
58.设置8个实验组，每组3个重复，培养基采用无机盐培养基(液体)，并按照150mg/l添加三氯乙烯，ph自然，接种后，分别设置不同的培养温度，设置实验温度为20-40℃(分别设置为20℃，25℃，28℃，30℃，33℃，35℃，38℃，40℃)，置于摇床中160r/min震荡培养，24h
后取样进行顶空气相检测，得到其最适的作用温度为25～40℃，详见图1；
59.2、不同ph条件下枯草芽孢杆菌yjy22-10对三氯乙烯的生物降解特性
60.设置7个实验组，每组3个重复，培养基采用无机盐培养基，并按照150mg/l添加三氯乙烯，分别设置不同的ph，设置ph实验范围为4-10(分别设置为4,5,6,7,8,9,10)，接种后，于摇床中30℃，160r/min震荡培养，24h后取样萃取进行检测，其可适应范围较广，得到其最适应用ph为6.5～8.0，详见图2。
61.3、枯草芽孢杆菌yjy22-10对不同初始浓度三氯乙烯的降解情况
62.共设置5个实验组，每一组设置三个重复，在磨口三角瓶中加入50ml的无机盐培养基，以三氯乙烯作为唯一的碳源，每个实验组三氯乙烯的初始浓度分别为146、293、586、879、1172mg/l，ph自然，30℃，160r/min培养，24h后取样检测其中三氯乙烯的残余量，其初始浓度在900mg/l以下时，其24h的降解率可以达到80％以上；初始浓度在150mg/l以下时，其24h的降解率可以达到100％左右。说明该菌株对三氯乙烯的毒性耐受性强，详见图3。
63.实施例5三氯乙烯降解菌在三氯乙烯污水处理中的模拟应用
64.按照实施例3的方法制备三氯乙烯降解菌剂，培养温度为33
±
1℃，控制溶氧为30％，得到的菌剂活菌数为5
×
108cfu/ml。
65.模拟应用：处理水质来源为一农药污水处理厂好氧段进水，处理量为5l，三氯乙烯降解菌剂的添加量按照0.3％(v/v)投加，室温下曝气处理使溶氧在2mg/l以上，污水ph6.0～8.0，原污水cod约4000mg/l，氨氮约380mg/l，有机胺约200mg/l，人为添加三氯乙烯浓度至100mg/l，24h后污水三氯乙烯含量《1mg/l，降解率达到99.9％以上。
66.实施例6三氯乙烯降解菌在三氯乙烯污水处理中的应用
67.按照实施例3的方法制备三氯乙烯降解菌剂，培养温度为35
±
1℃，控制溶氧为30％，得到的菌剂活菌数为1.5
×
10
10
cfu/ml。
68.处理水质来源为石化污水处理厂好氧池进水，处理量为10l，三氯乙烯降解菌剂的添加量按照0.2％(v/v)，室温下曝气处理使溶氧在2mg/l以上，污水ph6.0～8.0，三氯乙烯浓度为5mg/l以下，cod约2200mg/l，挥发酚约240mg/l，氨氮约100mg/l，硫化物约10mg/l，每24h进出水一次，检测进水后和出水中三氯乙烯的浓度，体系连续使用，根据跟踪的情况可以看出该菌具有连续的降解能力。
69.