一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物及其应用，尤其是涉及一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用。

背景技术：

1、益生菌被定义为“活的微生物，当给予足够的剂量时，会给宿主健康带来有益影响”。益生菌在人类用于预防和治疗传染性和非传染性疾病以及在家禽、牲畜、水产养殖中有广泛的应用。乳酸菌是目前应用较为广泛的一类益生菌，研究表明乳酸菌具有抗氧化作用、可降低血糖、血脂浓度、抗过敏作用、抗炎活性、免疫刺激等作用。

2、最近的研究表明，益生菌在维持口腔健康方面发挥着重要作用，它们通过产生有机酸、细菌素、过氧化氢和抗粘附分子赋予抗菌和抗生物膜特性从而发挥防龋作用。龋齿被认为是最普遍的非传染性疾病，多种环境因素包括口腔卫生、饮食、口腔状况、口腔细菌等，都会导致龋齿的发生。龋齿形成的主要原因是由糖基转移酶(gtfs)催化合成葡聚糖在牙齿表面形成一种致龋生物膜。变异链球菌是与龋齿密切相关的口腔细菌。作为早期的口腔殖民者，变异链球菌利用种间的共聚来促进后续物种的定殖并影响微生物的发病机理。如变异链球菌可发酵代谢碳水化合物产酸，大量的细菌使口腔环境过度酸化，与龋齿发生直接相关。变异链球菌分泌糖基转移酶(gtfs)，将蔗糖转化为胞内多糖(ips)和胞外多糖(epss)。eps有助于变异链球菌与牙齿表面的粘附和细胞与细胞之间的相互作用，从而增加牙菌斑厚度。蔗糖在产eps和产酸中的作用使其被认为是最容易引起龋齿的碳水化合物。目前，最常用的预防龋齿的化合物是氟化钠和氯已定。虽然氟化钠和氯己定具有抑制gtf作用，常被用于抗生膜治疗，但有研究表明氟化物的使用会导致变异链球菌产生耐药性，变异为耐药菌株。

3、北极狐为犬科动物狐，对其肠道微生物的研究较少。前期研究表明北极狐肠道存在复杂的微生物区系，在北极狐营养物质消化利用、维护机体健康和免疫功能方面发挥重要作用。现有研究已经在健康北极狐肠道中分离获得多种益生性能良好的益生菌。研究表明，来自特定宿主的益生菌能更好地适应该宿主的环境。因此，有必要研究北极狐来源的益生菌是否对于口腔健康有重要的益生功能。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用。本发明从健康北极狐肠道分离得到了唾液乳杆菌菌株zjbf 005，该菌株性能良好，对人工胃液和小肠液等酸性环境具有耐受性，对食源性致病菌的抑制活性，并对变异链球菌具有抑菌作用，在龋病的防治中具有重要意义。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、在一个方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株zjbf005，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctcc no:m 2022848。

4、本发明分离获得了唾液乳杆菌的生物纯培养物，结合16sr rna和生理生化鉴定结果将其命名为唾液乳杆菌zjbf005。唾液乳杆菌zjbf005在mrs培养基中生长迅速，具有较强的产酸能力；在ph 4.0～7.0之间生长良好，ph低于2.0生长受到抑制；在人工胃、肠液条件下培养3h后的存活率分别为40.96％和86.70％；可在0.2％的胆盐环境中生长；可抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长；对青霉素g、氯霉素、头孢孟多、克林霉素、环丙沙星等抗生素敏感，经过灌胃小鼠体重变化正常、无死亡、剖检无病理性变化。

5、在一个方面，本发明提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物含有前述的唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分；

6、优选地，所述益生菌组合物中，所述唾液乳杆菌的活菌数不低于1×108cfu/ml或1×108cfu/g。

7、在一个实施方案中，所述益生菌组合物包括固体组合物和液体组合物。例如所述益生菌组合物可以为液体、冷冻或干燥粉末形式。

8、在一个实施方案中，所述益生菌组合物还可包含其他适用于口腔健康的益生菌类型。

9、在一个方面，本发明提供了唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株或含有其的益生菌组合物在制备预防和/或治疗变形链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和/或枯草芽孢杆菌中的一种或多种引起的感染性疾病的药物中的应用。

10、本发明提供的唾液乳杆菌可抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长，对变异链球菌也具有抑菌活性；因此，可用于制备预防和/或治疗由以上这些菌种中的一种或多种引起的疾病。

11、在一个方面，本发明提供了唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株或含有其所述的益生菌组合物在制备预防和/或治疗龋病的药物或口腔护理品中的应用。

12、在一个实施方案中，所述口腔护理品包括牙膏、漱口液、口香糖、牙线、口腔清洗剂及口腔喷雾剂中的一种或多种。

13、本发明中，可以在漱口或使用其他口腔清洁产品的同时，使用含有唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株或所述益生菌组合物的护理产品，进而抑制龋齿菌与牙菌斑的产生，降低蛀牙与牙周病发生率。

14、在一个实施方案中，所述龋病包括龋齿症、牙周炎和牙髓炎中的一种或多种。龋病俗称虫牙、蛀牙，是细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。龋病中龋齿病和牙周炎的发生与口腔菌群失调密切相关，而变异链球菌是重要的口腔致病菌，是口腔主要的致龋齿菌之一。发明提供的唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)菌株具有较强的抑制变异链球菌生长的能力，可利用其来调整减少病原菌的生长、聚集，改善口腔微生态平衡，预防和治疗龋齿和牙周炎。

15、在一个实施方案中，所述龋病为变形链球菌(streptococcus mutans)引起的龋病。

16、在一个实施方案中，含有所述唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株的菌剂的制备方法包括：

17、(a)将所述唾液乳杆菌接种于乳酸细菌(man rogosa sharpe，mrs)液体培养基，厌氧条件下37℃恒温培养24h后进行传代、计数(浓度为1×1010cfu/ml)；

18、(b)按1:4、1:8和1:16的稀释比例(所述菌液和所述乳酸细菌培养基的体积比为1:4、1:8和1:16)，优选为1:4、1:8的稀释比，获得唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株的培养液(原菌液)或其上清液。

19、本发明中，采用牛津杯法检测唾液乳杆菌对变异链球菌的生长抑制作用；通过梯度稀释法筛选抑菌浓度，当唾液乳杆菌菌液稀释比例为1:4和1:8时抑菌活性较佳，抑菌圈直径分别为26、23mm；低浓度涂抹组、高浓度涂抹组和预防组龋齿评分达到阳性药物组水平(龋病编码≤1)，与阴性对照组有显著性差异(p＜0.05)。

20、在一个实施方案中，所述药物的剂型包括胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、膏剂、口服液、喷雾剂中的一种或多种。

21、在一个实施方案中，所述药物含有至少一种赋形剂；

22、优选地，所述赋形剂包括润滑剂、粘合剂、崩解剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、甘油、调味剂或乳化剂中的一种或多种。

23、本发明提供了唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株或含有其所述的益生菌组合物也可用于制备抗龋病的功能性食品，例如食品或饮料，例如咀嚼片、含片等。

24、本发明中，采用唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株的菌液处理(特别是高浓度灌胃处理)可以显著降低大鼠血清中的甘油三酯水平以及乳酸脱氢酶水平；显著升高大鼠血清抗炎因子(il-4和il-10)的水平，并且能够降低促炎因子(il-6和肿瘤坏死因子)的水平。本发明的唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株或含有其的益生菌组合物具有降甘油三酯的功能，可用于制备具有降甘油三酯功能的药品。

25、本发明还提供了所述唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株或含有其的所述益生菌组合物在制备药物的应用，所述药物包括以下一种或多种功能：

26、(a)降低甘油三酯；

27、(b)降低乳酸脱氢酶；

28、(c)促进抗炎因子表达；优选所述抗炎因子包括：白介素4和白介素10；

29、(d)抑制促炎因子表达；优选所述促炎因子包括：白介素6和肿瘤坏死因子；

30、(e)调节免疫力。

31、有益效果：

32、本发明提供了一株新的性能良好的唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株，该菌在胃ph值和肠胆汁等酸性环境中的生存能力良好，并且能够抑制有害细菌生长，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抑菌活性；该菌具有益生菌所必需的特性，对动物无毒副作用；

33、本发明菌株对口腔致病菌变异链球菌较强的抑制能力，具备在口腔环境良好存活的能力；通过利用变异链球菌建立大鼠龋齿模型，证实该菌在低浓度和高浓度涂抹时对变异链球菌所引起的龋病有抑制作用；

34、本发明可用于改善口腔的微生态体系，预防和/或治疗龋齿和牙周炎，本发明为应用于犬科动物提供理论基础，也为龋齿的治疗提供了新的方向；

35、本发明的菌株能够降低血清甘油三酯、乳酸脱氢酶，促进抗炎因子表达；抑制促炎因子的表达；对于调节肝脏代谢，提升免疫力有重要作用。

36、保藏信息：

37、本发明唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)菌株zjbf005保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：cctcc no:m 2022848。保藏日期为2022年06月09日；保藏地址为：中国，武汉，武汉大学；经保藏中心于2022年06月16日检测为存活菌株。