一种双药效团DNA编码化合物库的合成方法

本发明涉及dna编码化合物库，尤其涉及一种双药效团dna编码化合物库的合成方法。

背景技术：

1、新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。美国scripps研究院的sydney brenner和richard lerner教授于1992年提出了dna编码化合物库(dna encoded library，简称del)的概念，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的dna在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行dna标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并有相应的唯一碱基序列的dna标识。dna编码化合物库结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个dna标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势。dna编码化合物库技术正开始在制药行业广泛应用，并产生了诸多积极的效果(accounts ofchemical research,2014,47,1247-1255)。

2、在dna编码化合物库药物筛选技术的发展中，dna编码化合物库的合成与筛选是两个关键点，往往决定着药物筛选的成效。通常知道化合物库的复杂程度越高，即存在的不同结构基元、化学结构的数量越多，通过该化合物库发现具有目标活性的分子的可能性就越大。因此，在化合物库合成过程中，葛兰素史克(glaxosmithkline，前生为praecis公司)公司等以具有稳定共价的“发卡(hairpin)”结构的“头端(headpiece)”作为起始片段，结合“分组--合并--分组(split-pool-split)”策略实现化合物库的有效编码和合成；neri团队开发了dna编码自组装库的技术(encoded self-assembling chemical,esac)，基于两个或三个单链dna编码化合物库间dna链的互补自组装，实现化合物库化学结构和化学多样性的快速扩增，并实现亲和力成熟、扩大筛选靶标范围等。但由于esac技术中单链dna编码化合物库的合成会引入辅助dna试剂链增加成本和复杂性，非共价结合体系稳定性较低，还可能出现dna错配，且需要信息转移操作以进行解码操作等限制，因此，解决双药效团dna编码化合物库的高效合成技术具有重要技术与应用意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种双药效团dna编码化合物库的合成方法，通过构建可逆共价“y型”dna起始片段，提高了dna编码化合物库合成的高效性和筛选的灵活性。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、本发明公开了一种双药效团dna编码化合物库的合成方法，包括如下步骤：

4、构建可逆共价的“y-型”dna起始片段，形成不同黏性末端的dna编码片段的正交编码，合成双药效团dna编码化合物库；

5、进行双药效团dna编码化合物库与单药效团dna编码化合物库的可控转化，实现双药效团dna编码化合物库与单药效团dna编码化合物库的有效解码；

6、将dna编码化合物库与多种筛选体系兼容，扩大编码化合物库的靶标筛选范围，所述编码化合物库的筛选包括双药效团dna编码化合物库筛选和单药效团dna编码化合物库筛选；

7、将单药效团dna编码化合物库进行动态组合，构建动态dna编码化合物库，并利用共价可逆交联基团将动态结构进行平衡锁定；

8、将单药效团dna编码化合物库与其它单药效团化合物库进行组合，进行自组装多药效团库的构建；

9、通过dna杂交与共价交联，将单药效团dna编码化合物库与功能化合物dna偶合物进行结合，实现dna编码化合物库的多功能化。

10、在一些可选的实施方式中，所述构建可逆共价的“y-型”dna起始片段包括如下步骤：

11、分别合成带有x交联基团的三条单链dna，三条所述单链dna分别为单链ssdna-t、单链ssdna-b和单链ssdna-r，所述x交联基团为特殊交联基团或天然碱基；

12、所述可逆共价的“y-型”dna起始片段的构建策略一：

13、将两条含有特殊交联基团的单链dna与互补的不包含特殊交联基团的单链dna，通过共价交联化学反应，形成可逆共价的“y型”dna起始片段；

14、通过共价解离化学反应，将共价交联形成的“y型”dna起始片段解离为单链初始状态；

15、所述可逆共价的“y-型”dna起始片段的构建策略二：

16、分别合成带有x交联基团的三条单链dna，所述x交联基团为特殊交联基团或天然碱基；

17、将一条含有特殊交联基团的单链dna与互补的不包含特殊交联基团的单链dna，通过共价交联化学反应，形成具有共价结构的中间体dna；再与另外一条互补的含有特殊交联碱基的单链dna，通过共价交联化学反应，形成可逆共价“y型”dna起始片段；

18、通过共价解离化学反应，将共价交联形成的“y型”dna起始片段解离为单链初始状态；

19、所述可逆共价的“y-型”dna起始片段的构建策略三：

20、分别合成带有x交联基团的三条单链dna，所述x交联基团为特殊交联基团或天然碱基；

21、将三条含有特殊交联基团的单链dna，通过共价交联化学反应，形成新型可逆共价的“y型”dna起始片段；

22、通过共价解离化学反应，将共价交联形成的“y型”dna起始片段解离为单链初始状态；

23、所述可逆共价“y型”dna起始片段的构建循环次数不少于50次；

24、所述可逆共价的“y-型”dna起始片段包含有至少两个进行化合物库合成的反应位点r，且所述反应位点r与单链dna之间连接有连接子l。

25、在一些可选的实施方式中，所述单链ssdna-t、单链ssdna-b和单链ssdna-r两两之间均具有互补区域，每一段所述互补区域长度在0～30个碱基，所述单链ssdna-t、单链ssdna-b和单链ssdna-r中至少有一条单链dna中含有至少一个x交联基团；

26、所述x交联基团位于可逆共价的“y-型”dna起始片段上，所述x交联基团为以下特殊交联基团1-12中任意一种：

27、

28、所述天然碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶中任意一种。

29、在一些可选的实施方式中，所述双药效团dna编码化合物库与单药效团dna编码化合物库的可控转化包括如下步骤：

30、采用“split-pool-split”策略实现dna编码化合物库的合成；

31、将可逆共价的“y型”dna起始片段与化学结构基元进行dna兼容的化学反应，所述化学结构基元为羧酸、醛、烯烃、胺、硼酸、卤化物中任意一种；

32、加入每个化学结构基元对应的编码dna标签，通过dna连接酶或者化学方法将dna粘性末端进行连接；或分别在“y型”dna起始片段的两个化学反应位点加入一个化学结构基元后，再将两者对应的具有不同黏性末端的编码dna标签一并加入，通过dna连接酶或者化学方法将dna粘性末端进行连接；

33、每一维度中dna标签与化学结构基元的连接顺序可交换，采用组合化学的方式，将同一维度样品混合后再均分，进行下一维度合成；

34、在完成双药效团dna编码化合物库合成后，破坏共价键打开特殊“y-型”结构，使用选择性降解条件对建库过程中未连有编码化合物的dna链进行降解或分离，完成双药效团dna编码化合物库与单药效团dna编码化合物库的转化。

35、在一些可选的实施方式中，所述双药效团dna编码化合物库筛选包括如下步骤：

36、所述双药效团dna编码化合物库筛选策略一：

37、将已知活性化合物融入任一单药效团化合物库中，合成双药效团dna编码化合物库；

38、将双药效团dna编码化合物库与活性化合物的相关靶标进行孵育筛选；

39、未与靶标结合或具有弱亲和作用的化合物库成员通过选择性降解条件进行分离，与靶标具有更强亲和作用的化合物库成员被富集出来；

40、通过聚合酶链式反应进行，以及dna测序技术，解码被富集化合物库成员的结构信息。

41、所述双药效团dna编码化合物库筛选策略二：

42、将蛋白靶标作为双药效团dna编码化合物库的筛选底物；

43、将双药效团dna编码化合物库与靶标进行孵育筛选；

44、未与靶标结合或具有弱亲和作用的化合物库成员通过选择性降解条件进行分离，与靶标具有强亲和作用的化合物库成员被富集出来；

45、通过聚合酶链式反应进行，以及dna测序技术，解码被富集化合物库成员的结构信息。

46、在一些可选的实施方式中，所述单药效团dna编码化合物库筛选还包括如下步骤：

47、所述单药效团dna编码化合物库筛选策略一：

48、将单药效团dna编码化合物库与具有化学反应活性的dna探针进行杂交；

49、dna编码化合物库中具有亲和力的化合物与靶标结合时，拉近dna探针与靶标的距离，促进dna探针与靶标进行共价交联；

50、未与靶标结合的化合物dna偶联物通过选择性降解条件进行分离，与靶标结合的dna化合物偶合物被富集；

51、通过聚合酶链式反应进行扩增，以及dna测序技术解码化合物结构信息；

52、所述单药效团dna编码化合物库筛选策略二：

53、将单药效团dna编码化合物库与连有pcr引物序列dna的靶标共同孵育，将对靶标具有亲和力的化合物库成员与靶标所连接的dna引物序列的杂交结构进行pcr扩增，获得与靶标具有高亲和力的化合物的结构信息；

54、所述单药效团dna编码化合物库筛选策略三：

55、将单药效团dna编码化合物库与具有化学反应活性的dna探针进行杂交并共价交联；

56、化合物库中具有亲和力的化合物与靶标结合时，拉近dna探针与靶标的距离，促进dna探针与靶标进行共价交联，实现连接有化合物库信息的单链dna、具有化学反应活性的dna探针以及靶标三者的共价交联复合物；

57、利用靶标体外结合实验，分离出三者共价交联复合物，进而通过dna解码获取与靶标具有高亲和力化合物的结构信息。

58、在一些可选的实施方式中，所述选择性降解条件为核酸外切酶、化学反应条件、分离捕获中任意一种，所述酸外切酶为exoi、exoiii、λexo中任意一种。

59、在一些可选的实施方式中，所述动态组合化合物库的构建还包括如下步骤：

60、将双药效团dna编码化合物库转为单药效团dna编码化合物亚库a和亚库b，可分别与相应的单链dna编码化合物亚库c或亚库d进行动态组合；

61、在靶标的促进下，两个化合物库中具有亲和力的化合物dna偶联物相互靠近，促进dna互补区域的杂交；

62、利用特殊交联基团x的交联特性将杂交双链dna进行共价交联，稳定特定目标化合物的组合；

63、将双链dna的编码信息整合到同一条单链dna上，通过pcr扩增，以及dna测序等解码被富集化合物的结构信息。

64、在一些可选的实施方式中，所述自组装多药效团库的构建还包括如下步骤：

65、将单药效团dna编码化合物库通过自组装，并通过特殊交联基团x稳定自组装dna的结构；

66、将单链dna编码化合物亚库a、b、c杂交形成双药效团或三药效团化合物库，并扩大化合物库规模。

67、在一些可选的实施方式中，所述dna编码化合物库的多功能化还包括如下步骤：

68、将双药效团dna编码化合物库转为单药效团dna编码化合物库并与连有不同功能化合物的单链dna进行杂交；

69、再利用特殊交联基团x形成稳定的杂交结构，实现dna编码化合物库的多功能化。

70、采用上述技术方案的发明，具有如下有益效果：

71、(1)本发明的双药效团dna编码化合物库的合成方法，通过构建特殊的可逆共价“y型”dna(寡核苷酸)起始片段，构建编码区域为分叉型的“y型”dna编码化合物库，相比于传统的编码区域为线性的dna编码化合物库，能打破单药效团dna编码化合物库的合成局限，同时对多个亚库的化学信息进行编码，实现双药效团dna编码化合物库便捷合成技术的突破；

72、(2)本发明的“y型”双药效团dna编码化合物库的合成方法，能以分叉编码dna的形式，在保证编码的高效率条件下，快速扩大化合物库规模和多样性；

73、(3)本发明的“y型”双药效团dna编码化合物库的合成方法，相比于传统的自组装化合物库合成策略，无需单独进行亚库的合成，无需进行化合物库间的重组，dna连接酶介导的双链dna粘性末端的连接比单链dna夹板法的连接更为便捷高效；

74、(4)本发明的“y型”双药效团dna编码化合物库的合成方法，可直接采用商业化的编码dna，更适用于工业化应用；

75、(5)本发明的“y型”双药效团dna编码化合物库的合成方法，相比于传统的自组装化合物库具有更短的dna链长，更利于降低编码区对于配体结合的影响；

76、(6)本发明的“y型”双药效团dna编码化合物库的合成方法所构建的双药效团化合物库可用于亲和力成熟的筛选等应用；

77、(7)基于可逆共价“y型”dna(寡核苷酸)起始片段的设计，该策略可实现双药效团dna编码化合物库与单药效团dna编码化合物库之间的可逆互变转换；

78、(8)双药效团dna编码化合物库转化为单药效团dna编码化合物库后，通过与连有功能性化合物的dna交联，可实现化合物库筛选、化合物库检测、化合物库递送等功能。