一种腈水解酶及其在2-羟基-4-甲硫基丁酸合成中的应用的制作方法

本发明属于生物催化，涉及一种来源于变栖克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)的腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法及其在制备2-羟基-4-甲硫基丁酸中的应用。

背景技术：

1、2-羟基-4-甲硫基丁酸(hmtba)是蛋氨酸羟基类似物。在动物体内，hmtba可转化为蛋氨酸，与等量蛋氨酸具有相同的生物效价。此外，蛋氨酸羟基类似物还表现出一些特有性质，如良好的抑菌效果，增强动物机体免疫力及抗氧化能力，有效减缓应激反应的损害等。因此，hmtba作为一种性能优越的蛋氨酸源广泛用于家禽和猪的饲料添加剂。

2、蛋氨酸羟基类似物目前主要采用氰醇水解法制备，2-羟基-4-甲硫基丁腈(hmbtn)在硫酸催化下水合为2-羟基-4-甲硫基丁酰胺(hmtbam)，用水稀释后，升温完全水解为hmtba，然后用有机溶剂萃取。该方法需要使用强酸，反应在较高温度下进行，设备腐蚀严重，而且产生有毒的氢氰酸和大量的硫酸铵或硫酸氢氨，环境污染严重，产品分离困难。

3、利用生物催化法来进行腈的转化，其优势不仅在于反应条件温和、环境污染少，副产物少，还符合原子经济性、绿色环保和可持续发展的要求。

4、曹达公司和罗纳-普朗克公司等都对腈水解酶催化的2-羟基-4-甲硫基丁腈水解制备2-羟基-4-甲硫基丁酸工艺进行了研究，其反应如式(i)所示。李宗通等筛选到一株产腈水解酶的菌株，并利用该菌株的整细胞将hmtbn转化为hmtba，底物浓度为150mm，细胞只能使用一次。综上，现有腈类物质的生物催化法转化仍然存在酶对底物的耐受性差，转化强度不高等问题。

5、

6、综上所述，在现有的腈水解酶参与的生物催化法制备蛋氨酸羟基类似物技术路线中，仍然存在关键酶腈水解酶水解反应对底物的耐受性差，转化强度不高等问题，限制了其在工业规模的应用。因此，通过基因组数据挖掘等方法开发底物耐受性强的高效腈水解酶，绿色高效地制备蛋氨酸羟基类似物具有重要的工业应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法以及利用其作为催化剂，绿色高效水解制备蛋氨酸羟基类似物的应用，从而解决现有的腈水解酶催化合成蛋氨酸羟基类似物的技术存在的酶对底物的耐受性差，转化强度不高的问题。

2、本发明的发明人从德国微生物菌种保藏中心(dsmz)的菌株保藏编号为dsm 16265的变栖克雷伯氏菌(klebsiella variicola)中获得可以催化2-羟基-4-甲硫基丁腈水解制备2-羟基-4-甲硫基丁酸的腈水解酶kvnle，其氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:1所示；通过进一步对腈水解酶kvnle进行分子手段的改造，得到一种将其第168位脯氨酸替换为甲硫氨酸的突变体kvnle-p168m，其氨基酸序列如seq id no:6所示，核苷酸序列如seq id no:5所示；与kvnle相比，kvnle-p168m的2-羟基-4-甲硫基丁酸的生产效率显著提高，达7.4kg/kgdcw/h。

3、在第一方面，本发明提供一种腈水解酶kvnle，其氨基酸序列如seq id no:2所示，其可以催化2-羟基-4-甲硫基丁腈水解制备2-羟基-4-甲硫基丁酸。

4、本发明提供的上述腈水解酶kvnle可以是天然、重组或合成的活性多肽，具体地，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中产生的产物。

5、在一些实施方案中，上述腈水解酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化导入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建的重组基因工程菌株，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到腈水解酶。

6、在第二方面，本发明提供一种编码上述腈水解酶的核酸分子，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

7、本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。

8、在第三方面，本发明提供上述腈水解酶的突变体，其氨基酸序列如seq id no:6所示，与seq id no:2所示的氨基酸序列相比，第168位脯氨酸突变为甲硫氨酸，其在2-羟基-4-甲硫基丁酸的生产效率方面与上述腈水解酶相比有显著提高。

9、本发明提供的上述突变体可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。

10、在一些实施方案中，上述突变体是通过将含有其编码基因的重组载体转化进入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建重组基因工程菌，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到突变体。

11、在第四方面，本发明提供一种编码上述突变体的核酸分子，其核苷酸序列如seqid no:5所示。

12、本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。

13、第五方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。

14、在一些实施方案中，上述重组载体为pet26b(+)-kvnle或pet26b(+)-kvnle-p168m，分别是将编码上述腈水解酶的核酸分子或上述突变体的核酸分子替换pet-26b(+)的bamhi和ecori酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。

15、在第六方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。

16、在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述腈水解酶或突变体。

17、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：

18、将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到上述腈水解酶或突变体。

19、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组载体可稳定地自行复制，并且其所携带的基因可被有效表达即可，可以为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主e.coli bl21(de3)。

20、在一些实施方案中，所述重组细胞为重组菌e.coli bl21(de3)/pet26b(+)-kvnle和重组菌e.coli bl21(de3)/pet26b(+)-kvnle-p168m，重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达腈水解酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本发明的腈水解酶或其突变体的培养基，例如lb培养基。

21、培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并在适当温度条件下诱导表达腈水解酶及其突变体。优选的培养方法为：将重组菌e.coli bl21(de3)/pet26b(+)-kvnle或重组菌e.coli bl21(de3)/pet26b(+)-kvnle-p168m接种至含有卡那霉素的lb液体培养基的试管中，37℃、220rpm培养12小时，按1-2％(v/v)的接种量转接至装有100ml含卡那霉素的lb液体培养基的500ml三角摇瓶中，置于37℃、220rpm培养，当培养液的od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为100-500μm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16℃条件下诱导16-24小时后，将培养液离心，收集菌体沉淀，使用生理盐水洗涤，获得重组细胞。

22、更具体地，上述重组细胞的构建方法，可以包含如下步骤：

23、(1)腈水解酶kvnle的基因的扩增；

24、(2)重组表达质粒pet-26b(+)-kvnle的构建；

25、(3)重组表达质粒pet26b(+)-kvnle-p168m的获得；

26、(4)重组表达质粒pet-26b(+)-kvnle和pet26b(+)-kvnle-p168m转化进入宿主细胞；

27、(5)平板抗性培养基筛选得到阳性克隆菌株。

28、在第七方面，本发明提供一种腈水解酶或其突变体的制备方法，包括：

29、对上述任一所述的重组细胞进行培养并加入诱导剂诱导，得到培养物；

30、从所述培养物中分离上述腈水解酶或其突变体；

31、其中，对重组细胞进行培养并诱导的方法、将腈水解酶及其突变体从培养物中分离出来的方法均为本领域的常规方法。

32、在第八方面，本发明提供上述腈水解酶、上述核酸分子、上述突变体、上述任一所述的重组载体、上述任一所述的重组细胞和/或上述方法制备得到的腈水解酶或其突变体在制备2-羟基-4-甲硫基丁酸中的应用。

33、在第九方面，本发明提供一种2-羟基-4-甲硫基丁酸的制备方法，包括以下步骤：以上述腈水解酶、上述突变体、上述任一所述的重组细胞和/或上述方法制备得到的腈水解酶或其突变体作为催化剂，催化2-羟基-4-甲硫基丁腈进行水解反应，制备2-羟基-4-甲硫基丁酸。

34、在一些实施方案中，上述方法中，所述水解反应的温度为20-40℃，例如20℃、30℃、40℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，其中优选30℃；所述水解反应的ph为5-9，例如ph5、ph6、ph7、ph8、ph9，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，其中优选ph8；所述反应投料包括：2-羟基-4-甲硫基丁腈、氨；

35、2-羟基-4-甲硫基丁腈的终浓度为30-250mm，例如30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、150mm、200mm、250mm，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，其中优选250mm；

36、氨的添加量为2-羟基-4-甲硫基丁酸理论产量的1.5-10倍当量，例如1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍当量，优选3倍当量。

37、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述水解反应使用的缓冲液为本领域常规缓冲液，如tris-hcl缓冲液，其浓度较佳为100mm。

38、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，包括用上述任一所述的重组细胞催化2-羟基-4-甲硫基丁腈进行水解反应，制备2-羟基-4-甲硫基丁酸；

39、具体地，可以以上述重组细胞的冻干细胞或冻干粉作为催化剂进行全细胞催化生产2-羟基-4-甲硫基丁酸，冻干细胞或冻干粉的用量为0.01-0.05g/g 2-羟基-4-甲硫基丁腈，优选0.03g/g 2-羟基-4-甲硫基丁腈。其中，冻干粉是将上述任一所述的重组细胞进行破碎，获得细胞破碎液，再将细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉，冻干细胞是将重组细胞不经破碎直接冻干得到的。

40、应当理解的是，本发明所述的腈水解酶kvnle或其突变体kvnle-p168m可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的腈水解酶kvnle或其突变体kvnle-p168m制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。

41、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述水解反应在搅拌或者振荡的环境下进行，例如在100-500rpm搅拌下反应。

42、本发明的有益效果如下：

43、本发明提供的腈水解酶能够高效催化2-羟基-4-甲硫基丁腈生成2-羟基-4-甲硫基丁酸，尤其是突变体kvnle-p168m底物转化率达到99％，2-羟基-4-甲硫基丁酸的生产效率高达7.4kg/kgdcw/h，对于绿色高效地制备蛋氨酸羟基类似物具有重要的工业应用价值。