一种双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器及应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器及应用。

背景技术：

1、一些重金属元素(如铅、镉、汞、铬等)，已知没有任何生物学功能，在极低浓度时就对生物体产生毒性。此外，这类元素在自然环境中无法生物降解并具有生物蓄积性。近年来全球经济的迅猛发展，导致了“重金属的再分布”，由此引发了一系列严重的污染事件，环境保护越来越成为世界范围内普遍关注的问题。对环境重金属毒物进行合理、准确的监测是开展污染防控的前提。全细胞生物传感器通过模拟环境生物感知可生物利用形态的重金属，整合了环境污染理化监测及生物监测等传统手段的功能，对预测有毒重金属生态毒性及环境风险意义重大，有望成为主流仪器检测手段的有力补充。

2、以天然色素合成基因簇作为报告基因模块，突破传统生物传感信号过度依赖仪器读取的瓶颈，有望实现基于颜色变化的成本低廉、快速响应、降低仪器依赖性的重金属生物传感，肉眼识别重金属的暴露，相关研究鲜有报道。

3、紫色杆菌素是由紫色色杆菌产生的脂溶性色素。近年来，随着紫色杆菌素合成途径的阐明，其异源合成已成为可能。基于最近阐明的紫色杆菌素分支生物合成途径，其中间体proviolacein(pv)是一种绿色素。目前尚未有以pv衍生物为输出信号的铅离子微生物全细胞生物传感器的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器及应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种重组菌。

3、本发明所要求保护的重组菌是通过向受体菌中导入重组载体a后所得。

4、所述重组载体a中含有dna片段a。

5、在所述dna片段a上，含有pbr双向启动子，所述pbr双向启动子的一侧为pbrr蛋白编码基因，另一侧为proviolacein(pv)合成基因簇vioabde。

6、所述proviolacein(pv)合成基因簇vioabde以四顺反子形式组装，编码vioa蛋白、viob蛋白、viod蛋白和vioe蛋白。

7、所述pbr双向启动子的核苷酸序列为seq id no.1的第442-526位。

8、所述pbrr蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

9、所述vioa蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

10、所述viob蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

11、所述viod蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。

12、所述vioe蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。

13、所述pbrr蛋白的编码基因的核苷酸序列为seq id no.1的第7-441位的反向互补序列。

14、所述vioa蛋白的编码基因的核苷酸序列为seq id no.1的第569-1825位。

15、所述viob蛋白的编码基因的核苷酸序列为seq id no.1的第1843-4839位。

16、所述viod蛋白的编码基因的核苷酸序列为seq id no.1的第4857-6008位。

17、所述vioe蛋白的编码基因的核苷酸序列为seq id no.1的第6026-6601位。

18、进一步地，所述醇溶性pv合成基因簇vioabde的核苷酸序列为seq id no.1的第569-6601位。

19、更进一步地，所述dna片段a的核苷酸序列为seq id no.1。

20、所述重组载体a为将所述dna片段a替换pet-21a(+)质粒的酶切位点bglii和saci之间的小片段后所得。

21、进一步地，所述受体菌为大肠杆菌。

22、在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌top10。

23、第二方面，本发明要求保护一种成套产品。

24、本发明所要求保护的成套产品，包含：

25、(a1)前文第一方面中所述的重组菌；和

26、(a2)正丁醇。

27、进一步地，所述成套产品还可包含如下：

28、(a3)氧化剂。

29、在本发明的一个实施例中，所述成套产品由所述(a1)和所述(a2)组成。

30、在本发明的另一个实施例中，所述成套产品由所述(a1)、所述(a2)和所述(a3)组成。

31、在本发明的具体实施方式中，所述氧化剂为双氧水，具体为30％双氧水(质量分数，基质为水)。

32、第三方面，本发明要求保护如下应用：

33、(b1)前文第一方面中所述重组菌或前文第二方面中所述的成套产品在制备以proviolacein(pv)衍生物为双色输出信号的铅离子细菌全细胞生物传感器中的应用。

34、(b2)前文第一方面中所述重组菌或前文第二方面中所述的成套产品在检测铅离子中的应用。

35、进一步地，所述检测铅离子为对液体样本进行铅离子的定性和/或定量检测。

36、第四方面，本发明要求保护如下任一方法：

37、方法一：一种检测液体样本中是否含有铅离子的方法，为方法a或方法b或方法c或方法d：

38、方法a：非氧化条件下菌液观察法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇涡旋震荡5min(萃取)，将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，观察所述萃取液颜色变化，若观察到褐色的显色反应，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子。

39、方法b：氧化条件下菌液观察法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇和氧化剂(如双氧水)涡旋震荡5min(萃取)，将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，观察所述萃取液颜色变化，若观察到绿色的显色反应，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子。

40、方法c：非氧化条件下a652值检测法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇，涡旋震荡5min(萃取)后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定a652值，简称所述待测液体样本组的a652值；若所述待测液体样本组的a652值显著大于对照组的a652值，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子；其中，所述对照组的a652值的测定方法与所述待测液体样本组的a652值的测定方法相比差别仅在于将所述待测液体样本替换为不含有铅离子的液体样本。

41、方法d：氧化条件下a652值检测法，可包括如下步骤：将前文第一方面中所述重组菌置于所述待测液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇和氧化剂(如双氧水)，涡旋震荡5min(萃取)后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定a652值，简称所述待测液体样本组的a652值；若所述待测液体样本组的a652值显著大于对照组的a652值，则所述待测液体样本中含有或者候选含有铅离子；否则，所述待测液体样本中不含有或者候选不含有铅离子；其中，所述对照组的a652值的测定方法与所述待测液体样本组的a652值的测定方法相比差别仅在于将所述待测液体样本替换为不含有铅离子的液体样本。

42、方法二：一种检测液体样本中铅离子含量的方法，可为方法e或方法f：

43、方法e：非氧化条件下a652值检测法，可包括如下步骤：

44、(e1)将前文第一方面中所述重组菌置于系列已知浓度的铅离子液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇，涡旋震荡5min后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定a652值，然后根据铅离子浓度和a652值绘制标准曲线；

45、(e2)以待测液体样本替换步骤(e1)中的系列已知浓度的铅离子液体样本，重复步骤(e1)，得到所述待测液体样本的a652值，代入所述标准曲线，得到所述待测液体样本中铅离子含量。

46、方法f：氧化条件下a652值检测法，可包括如下步骤：

47、(f1)将前文第一方面中所述重组菌置于系列已知浓度的铅离子液体样本中，37±2℃(如37℃)震荡培养5h，然后向培养体系中加入正丁醇和氧化剂(如双氧水)，涡旋震荡5min(萃取)后将萃取液常温静置6h以上(如6-10h，具体如6h)，取上清有机相测定a652值，然后根据铅离子浓度和a652值绘制标准曲线；

48、(f2)以待测液体样本替换步骤(f1)中的系列已知浓度的铅离子液体样本，重复步骤(f1)，得到所述待测液体样本的a652值，代入所述标准曲线，得到所述待测液体样本中铅离子含量。

49、进一步地，所述方法(氧化条件下a652值检测法)适用于所述待测液体样本中含有0.183nm以上(如0.732nm以上)铅离子的情况。所述方法(非氧化条件下a652值检测法)适用于所述待测液体样本中含有5.86nm以上铅离子的情况。

50、在本发明的具体实施方式中，所述氧化剂为30％ h2o2(质量分数，基质为水)。

51、在上述各非氧化处理的方法中，正丁醇的加入量为：每900μl的含所述重组菌的培养体系中加入180-360μl的正丁醇。

52、在上述各氧化处理的方法中，正丁醇的加入量为：每900μl的含所述重组菌的培养体系中加入180-360μl的正丁醇；氧化剂(如30％ h2o2)的加入量为：每900μl的含所述重组菌的培养体系中加入50μl的氧化剂(如30％ h2o2)。

53、当所述待测液体样本自身为无色或者叠加显色反应后能够与自身颜色相区分(肉眼可辨)时，所述方法一优选采用肉眼观察法(即所述方法a和所述方法b)进行结果判定。当所述待测液体样本叠加显色反应后很难与自身颜色相区分(肉眼不可辨)时，所述方法一优选采用a652值测定法(即所述方法c和所述方法d)进行结果判定。

54、在上述各方面中，所述待测液体样本可为疑似含有铅离子的纯化水、自来水、湖水或土壤提取物溶液。

55、在上述各方面中，所述铅离子为二价铅离子(pb(ii))。

56、在上述各方面中，所述铅离子优选以可溶性二价铅盐形式存在，如醋酸铅、氯化铅、硝酸铅等。

57、本发明重组菌可用于环境样本可生物利用形态的铅离子的定性及定量检测。