极光激酶B基因K85和K87突变及其应用

本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域，具体而言涉及极光激酶b基因中编码氨基酸位点k202的突变以及应用。

背景技术：

1、已有的研究证实极光激酶(aurora kinase)b在乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、弥漫性大b淋巴瘤、burkitt’s和hodgkin’s淋巴瘤等多种不同肿瘤中高频表达，在肿瘤发生、发展、转移和耐药多个环节发挥重要作用，并且与不良预后相关。这些研究突显了极光激酶b在肿瘤转化中的作用，因此极光激酶b成为肿瘤治疗的靶标。国际药商默克、阿斯利康和辉瑞等纷纷致力于靶向aurora家族药物的研发，多个靶向极光激酶b激酶的小分子化合物已经在全球多中心开展了i期、ⅱ期或iii期临床试验。例如，azd1152(barasertib)，一种特异地选择性靶向极光激酶b激酶的小分子药物，针对恶性实体瘤(nct00497731)和复发/难治性弥漫性大b淋巴瘤(nct01354392)进行了i/ii期临床试验，针对急性髓性白血病(aml)(nct00497991)(nct00952588)进行了i/ii/iii期临床试验。尽管这些药物显示出一定的抗肿瘤效果，但剂量依赖的毒性(中性粒毒性)仍然是它的一个主要问题，目前尚没有批准进入临床应用。但研究者们仍在尝试寻找减毒、增效或与其它治疗药物联合应用的方法，以期促进极光激酶b激酶的抑制剂进入临床市场。

2、极光激酶b蛋白的翻译后修饰对其在有丝分裂过程中的正确定位及激酶活性有很重要的调节作用。本发明人研究发现，k63-连接的泛素化修饰对极光激酶b的活性有很重要的调节作用。泛素(ubiquitin,ub)是一个只有76个氨基酸的小分子。在泛素活化酶e1、泛素偶联酶e2和泛素连接酶e3的作用下，泛素分子c端的gly残基与靶蛋白上的lys残基发生共价连接，从而给靶蛋白打上泛素的标签。泛素分子本身含有7个lys残基(k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63)，连同可以用作次级附着点的n末端蛋氨酸(m1)，可以形成具有不同结构和功能的各种泛素链，不同类型的泛素链赋予蛋白质不同的功能及命运。例如，k48连接的多聚泛素链标定蛋白质到蛋白酶体降解，k63连接的多聚泛素链为蛋白-蛋白间的相互作用提供平台，通过改变靶蛋白的稳定性、影响靶蛋白的定位和功能活性等参与蛋白质转运、dna损伤修复和免疫应答等。本发明人通过蛋白质质谱分析和定点突变等技术证明，极光激酶b激酶的第85和87位赖氨酸残基k是其潜在的泛素化位点，这些位点的突变即第85或87位赖氨酸的突变，尤其是k85和k87双突变使得极光激酶b的其他位点泛素化水平增加，进而导致其磷酸化水平升高，活性增强，促进细胞的增殖。因此极光激酶b激酶的k85和k87位点的突变可以用作易患肿瘤的标志，或者作为极光激酶抑制剂的增敏剂用于肿瘤的治疗药物，以及用于筛选极光激酶抑制剂增敏剂的方法或用途。

技术实现思路

1、本发明发现seq id no.1所示人极光激酶b第85或87位或者两者的赖氨酸发生突变后导致其他位点的k63类型的泛素化增加，从而使得第232位苏氨酸磷酸化增加，结果出现促进细胞增殖的效果。并且预计其他的人极光激酶蛋白中，经过氨基酸序列比对，对应于与seq id no.1第85和/或87位置上的赖氨酸发生突变后也存在相同的效果。

2、因此，本发明的第一方面涉及人极光激酶突变体蛋白，其是极光激酶b、极光激酶c或极光激酶a的突变体蛋白，其特征在于，seq id no.1第85和/或87位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，或者经过氨基酸序列比对对应于seq id no.1第85和/或87位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失。其中，第85和/或87位置在本技术中是指第85位置或者第87位置或者第85和87两个位置。

3、在优选的实施方案中，所述人极光激酶突变体蛋白的特征在于，seq id no.2第44和/或46位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，seq id no.3第86和/或88位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，seq id no.4第45和/或47位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，seq idno.5第85位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，seq id no.6第51和/或53位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，seq id no.7第32和/或34位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，seq id no.8第17和/或19位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者seq id no.9第141和/或143位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代。

4、在进一步优选的实施方案中，所述人极光激酶突变体蛋白的特征在于，所述被非赖氨酸替代是被精氨酸或组氨酸替代。

5、本发明的第二方面涉及人极光激酶突变体核酸，其编码所述的人极光激酶突变体蛋白。

6、本发明的第三方面涉及一种载体，其包含所述人极光激酶突变体核酸。

7、本发明的第四方面涉及一种鉴定本发明所述突变体蛋白或所述突变体核酸的工具，针对本发明所述人极光激酶突变体蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段、针对本发明所述突变体核酸的引物对或探针。

8、本发明的第五方面涉及本发明的突变体蛋白或突变体核酸或本发明的载体用于制备治疗肿瘤的药物组合物的用途，其特征在于，药物组合物包括本发明的人极光激酶突变体蛋白或突变体核酸或载体，此外还包括极光激酶抑制剂cyc-116、极光激酶a抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-in-2、sch-1473759、tak-901、mln8054、kw-2449、逆转素、tak-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶a抑制剂1、mk-5108、tripolin a、at9283、zm-447439、酞嗪酮吡唑、tinengotinib、amg 900、阿立塞替、阿立塞替钠、pf-03814735、极光激酶抑制剂1、nu6140、极光激酶抑制剂3、tc-a2317盐酸盐、gsk-1070916、as-703569、ly3295668、极光激酶抑制剂-9、cct241736、derrone、达鲁舍替、abt-348、abt-348盐酸盐、sns-314、极光激酶抑制剂-10、enmd-2076、cd532、hesperadin、azd1152、azd2811、aapk-25、cct129202、cct-137690、chiauranib、jnj-7706621、mk-8745、pha-680632、tc-s 7010、bi-847325、bi-831266、bi-811283、tas-119、jab-2000、vic-1911、js112或jab-2485等极光激酶抑制剂，所述肿瘤是血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、cd30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤、waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌。

9、本发明的第六方面涉及一种用于预测人是否易患肿瘤的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

10、(a)测定所述人样品中是否表达所述的人极光激酶突变体蛋白；和/或

11、(b)测定所述人样品中是否存在所述的人极光激酶突变体核酸；

12、(c)若(a)中测定结果确定人样品中表达所述的人极光激酶突变体蛋白和/或(b)中测定结果确定人样品中存在所述的人极光激酶突变体核酸，则其易患肿瘤。

13、本发明的第七方面涉及一种用于预测患有肿瘤的患者对人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

14、(a)测定所述患者样品中是否表达所述的人极光激酶突变体蛋白；和/或

15、(b)测定所述患者样品中是否存在所述的人极光激酶突变体核酸；

16、(c)若(a)中测定结果确定患者样品中表达所述的人极光激酶突变体蛋白和/或(b)中测定结果确定患者样品中存在所述的人极光激酶突变体核酸，则患者对于人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物的治疗发生响应。

17、在优选的实施方案中，极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物是cyc-116、极光激酶a抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-in-2、sch-1473759、tak-901、mln8054、kw-2449、逆转素、tak-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶a抑制剂1、mk-5108、tripolin a、at9283、zm-447439、酞嗪酮吡唑、tinengotinib、amg 900、阿立塞替、阿立塞替钠、pf-03814735、极光激酶抑制剂1、nu6140、极光激酶抑制剂3、tc-a 2317盐酸盐、gsk-1070916、as-703569、ly3295668、极光激酶抑制剂-9、cct241736、derrone、达鲁舍替、abt-348、abt-348盐酸盐、sns-314、极光激酶抑制剂-10、enmd-2076、cd532、hesperadin、azd1152、azd2811、aapk-25、cct129202、cct-137690、chiauranib、jnj-7706621、mk-8745、pha-680632、tc-s 7010、bi-847325、bi-831266、bi-811283、tas-119、jab-2000、vic-1911、js112或jab-2485等极光激酶抑制剂，所述患有肿瘤的患者是患有血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、cd30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤、waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌的患者。

18、本发明的第八方面涉及一种筛选治疗肿瘤的候选药物的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

19、(a)设置对照细胞组和测试细胞组，其中测试细胞组的细胞表达所述的人极光激酶突变体蛋白，或者测试细胞组的细胞包含所述的人极光激酶突变体核酸或所述的载体；

20、(b)分别向对照细胞组和测试细胞组加入测试药物；

21、(c)分别检测对照细胞组和测试细胞组的细胞增殖速度；

22、(d)若测试细胞组的细胞增殖速度小于对照细胞组的细胞增殖速度，则所测试药物选择作为治疗肿瘤的候选药物。

23、本发明的第九方面涉及所述突变体蛋白或所述突变体核酸用于预测人是否易患肿瘤的用途、用于预测患者对人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的用途、或用于筛选治疗肿瘤的候选药物的用途。

24、本发明第十方面涉及极光激酶抑制剂，其特征在于，极光激酶抑制剂与本发明所述人极光激酶突变体蛋白的结合亲和力高于其与人极光激酶野生型蛋白的结合力高。