唾液乳杆菌及在制备治疗和/或预防糖尿病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及唾液乳杆菌lf01及其在制备治疗和/或预防糖尿病药物中的应用。


背景技术：

2.2型糖尿病(t2dm)是一种严重的代谢疾病，由肥胖和炎症促进，是全球主要的健康问题。由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌异常，t2dm患者不能充分控制血糖，最终导致并发症，包括慢性肾病、心血管疾病、青光眼、白内障和腿部水肿。因此，必须仔细控制和监测这类患者的血糖水平。
3.饮食调整和定期锻炼有助于控制或预防t2dm的发展。低碳水化合物、生酮、素食和地中海饮食已被证明可以改善t2dm患者的血糖水平。许多抗糖尿病药物可以通过减少糖的吸收、增强胰岛素的产生、抑制低多糖及蔗糖分解成为葡萄糖来维持血糖在正常水平。
4.生活方式的改变和抗糖尿病药物可能并不总是适合所有的2型糖尿病患者，特别是那些老年人、残疾人或药物过敏患者。此外，抗糖尿病药物的副作用，包括乳酸中毒和关节痛，会显著降低患者的生活质量。虽然注射胰岛素相对安全，但低钾血症仍然是这种治疗方案的主要副作用，因为它增加了钾的吸收。除了改变生活方式和药物治疗外，补充益生菌可能是2型糖尿病患者血糖管理的另一种选择。具有治疗糖尿病作用的益生菌因其副作用小、低价格并且具有其他益生功效等特点，已被公众广泛接受。
5.最近的荟萃分析证实，肠道菌群组成的改变有助于人类胰岛素抵抗的发展。通过益生菌改变肠道菌群的组成已经引起了寻求控制胰岛素抵抗新方法的研究人员的大量关注。双歧杆菌和乳杆菌是益生菌中最常见的肠道菌群，在一些临床试验中报道了它们通过不同的机制对血糖产生有益影响。从韩国泡菜中分离出植物乳杆菌hac01通过恢复糖尿病小鼠的肠道菌群组成来改善血糖水平。然而，目前益生菌在预防和/或治疗糖尿病中的研究和应用依然较少。
6.因此，如何提供一株可以有效预防或治疗糖尿病的益生菌菌株，并将其应用于制备治疗和/或预防糖尿病药物中是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一株唾液乳杆菌lf01，并将其应用于在制备治疗和/或预防糖尿病药物中。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一株唾液乳杆菌，所述唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)为唾液乳杆菌lf01，于2021年08月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23313，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为唾液乳杆菌lactobacillus salivarius。
10.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护唾液乳杆菌lf01在制备
治疗和/或预防糖尿病药物中的应用。
11.优选地，所述唾液乳杆菌lf01能显著降低高血糖斑马鱼体内葡萄糖含量，表现出潜在的治疗和/或预防糖尿病作用。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护唾液乳杆菌lf01在抑制α-葡萄糖苷酶中的应用。
13.优选地，所述唾液乳杆菌lf01能显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
14.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种治疗和/或预防糖尿病的药物，其特征在于，包括唾液乳杆菌lf01菌悬液。
15.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株唾液乳杆菌lf01，并提供了唾液乳杆菌lf01在制备治疗和/或预防糖尿病药物中的应用，唾液乳杆菌lf01是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在体外具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的作用，在体内能显著降低斑马鱼高血糖模型体内葡萄糖含量，具备应用于体内调节血糖水平的潜能，此为利用唾液乳杆菌lf01开发预防或治疗糖尿病的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
17.图1附图为本发明唾液乳杆菌lf01在mrs琼脂平板上的菌落形态；
18.图2附图为本发明弯曲乳杆菌lc02在mrs琼脂平板上的菌落形态；
19.图3附图为本发明罗伊氏乳杆菌e8在mrs琼脂平板上的菌落形态；
20.图4附图为本发明唾液乳杆菌lf01、弯曲乳杆菌lc02、罗伊氏乳杆菌e8对α-葡萄糖苷酶的抑制率；
21.图5附图为本发明唾液乳杆菌lf01对高血糖斑马鱼体内的葡萄糖含量的影响；
22.图6附图为本发明唾液乳杆菌lf01对降糖率的影响。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1唾液乳杆菌lf01分离、鉴定及保藏
25.(1)分离：
26.1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管中，用1ml无菌枪头充分吹打混匀，备用。
27.2)在6个无菌1.5ml离心管中各加入900ul的无菌生理盐水。
28.3)从第1个装有10-1
样品稀释液的离心管中，吸取100ul的液体加入第2个离心管
(10-2
)，稀释到10-2
；
29.4)从第2个装有10-2
样品稀释液的离心管中，吸取100ul的液体加入第3个离心管(10-3
)，稀释到10-3
；
30.5)重复上个步骤，一直稀释到10-4
、10-5
、10-6
、10-7
。
31.6)从装有10-4
样品稀释液的离心管中吸取100ul的样品稀释液涂布在分别接种于mrs固体培养基、bs固体培养基中上，将100ul的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
32.7)重复上个步骤，完成10-5
、10-6
、10-7
稀释梯度的稀释涂布。
33.8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
34.9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至mrs固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
35.10)将平板上的纯菌落接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
36.(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组dna，通过pcr技术利用16s rdna通用引物27f和1492r扩增16s rdna全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
37.其中，通用引物27f和1492r的引物序列如下：
38.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；seq id no.1；
39.1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’；seq id no.2。
40.实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16s rdna鉴定，其中菌株lf01被鉴定为唾液乳杆菌，其16s rdna序列如seq id no.3所示。
41.ggttactctcgatacgcacctatggttacttgttacgacttcctgagccaggatcaaactctatggttaccttgttacgacttcctgagccaggagcaaactctatggttaccttgttaccactacctgctgattcacgattactaacgattccgacttcatgtatgcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacggctttaagagattagctaaacctcgcggtctcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcgccagagtgcccaacttaatgctggcaactgacaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtcactttgtccccgaagggaaagcctaatctcttaggtggtcaaaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttattgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccacgctttcgaacctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactctcctcttctgcactcaagtcttccagtttccaatgcactactccggttaagccgaaagctttcacatcagacttaaaagaccgcctgcgttccctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcgctgctggcacgtagttagccgtgacttgctgtttagataccgtcatcgaatgaacagttactcctcactcgtgttcttctctaacaacagagtttacggatccgaagaccttcttcactcacgcggcgtgctccatcagacttgcgtcatggtgagattcctactgctgcctcccggtaggatttgaccggtctcaattccatgtggccgatcacctctccagtccgctacgtatcctcacctgtagccgttacccacactatttataccgcgatccatcttaagccgataagcgaagaact；seq id no.3。
42.菌株lf01单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白色、边缘整齐，呈球形、表面光滑(图1)。菌株lf01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年08月30日，分类命名为唾液乳杆菌lactobacillus salivarius，保藏编号为cgmcc no.23313。
43.同时，从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16s rdna鉴定，其中菌株lc02被鉴定为弯曲乳杆菌，其16s rdna序列如seq id no.4所示。
44.cttagacggctggctccgaggttacctcaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggttttaagagattagctaaacctcgcggtctcgcgactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactttgtccccgaagggaaagctctatctctagagtggtcaaaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcactacctgatcagttactatcaaatacgttcttctccaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgattaccctctcaggtcggctatgcatcacggtcttggtgagcctttacctcaccaactaactaatgcaccgcgggtccatcctaaagtgatagccgaaaccatctttcaaccttgcaccatgcggtgctaggttttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccactttagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcactcaaatgttatcaatcagaagcaagcttcttcaatctaacgagagtgcgtcgactgcatgtatag；seq id no.4。
45.菌株lc02单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白色、呈圆形、表面光滑(图2)。菌株lc02已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年07月30日，分类命名为弯曲乳杆菌lactobacillus curvatus，保藏编号为cgmcc no.22986。
46.从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16srdna鉴定，其中菌株e8被鉴定为罗伊氏乳杆菌，其16s rdna序列如seq idno.5所示。
47.ttaggcggctccctccataaaggttaggccaccgactttgggcgttacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaacggctttaagagattagcttactctcgcgagcttgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaacttaatgctggcaactagtaacaagggttgcgctcgttgcg
ggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtcattgcgtccccgaagggaacgccttatctctaaggttagcgcaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctccggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcattccaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtcgcccggtttccgatgcacttcttcggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagcaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttggataccgtcactgcgtgaacagttactctcacgcacgttcttctccaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggtgttgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtatggaccgtgtctcagttccattgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagccgttaccttaccaactagctaatgcaccgcaggtccatcccagagtgatagccaaagccatctttcaaacaaaagccatgtggcttttgttgttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccgctccggggcaggttacctacgtgttactcacccgtccgccactcactggtgatccatcgtcaatcaggtgcaagcaccatcaatcagttgggccagtgcgtacgacttgca；seq id no.5。
48.菌株e8单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃厌氧条件下生长良好，菌落乳白色、呈球形、表面光滑(图3)。菌株e8已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月29日，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri，保藏编号为cgmcc no.21769。
49.实施例2唾液乳杆菌lf01、弯曲乳杆菌lc02、罗伊氏乳杆菌e8菌悬液(菌体)的制备
50.将唾液乳杆菌lf01、弯曲乳杆菌lc02、罗伊氏乳杆菌e8活化培养后分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经pbs两次洗涤后，将菌体用pbs重新悬浮，调整细胞浓度为调整细胞浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml得到菌悬液(菌体)。
51.实施例3唾液乳杆菌lf01、弯曲乳杆菌lc02、罗伊氏乳杆菌e8对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力分析
52.α-葡糖苷酶、硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷、碳酸氢钠、阿卡波糖均购自上海源叶生物科技有限公司。
53.将100μl 1u/mlα-葡糖苷酶(0.1m pbs，ph 6.8与50μl的样品(1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml唾液乳杆菌lf01、弯曲乳杆菌lc02、罗伊氏乳杆菌e8)混合于1.5ml离心管中。在37℃水浴下预孵育10min后，添加50μl 5mm对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg，0.1m pbs，ph 6.8)作为底物。酶促反应在37℃水浴下进行30min，并通过添加1ml的0.1m na2co3(蒸馏水)终止反应。取200μl反应液置于96孔细胞培养板中，α-葡萄糖苷酶活性是通过在405nm处测量od值对硝基苯酚从pnpg中的释放来确定的。没有样品的溶剂用作空白组，没有底物的溶剂用作溶剂调零组，阿卡波糖作阳性对照。每组试验重复6次，取其平均值。α-葡糖苷酶活性百分比计算如下：
[0054][0055]
采用spss 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x
±
sd数据表示，用单因素方差分析。与空白组相比：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.005。
[0056]
结果见图4；由图4可知，与空白组(100.00
±
6.90％)相比，阿卡波糖阳性对照组的α-葡萄糖苷酶活性(49.87
±
5.66％)相比显著降低(p《0.005)，说明阿卡波糖具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，与临床结果一致。
[0057]
弯曲乳杆菌lc02和罗伊氏乳杆菌e8浓度为1
×
106cfu/ml时，α-葡萄糖苷酶活性分别为89.85
±
4.02％和86.64
±
4.17％，与空白组(100.00
±
6.90％)相比均差异性显著(p《0.05)。另外，唾液乳杆菌lf01浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml和1
×
106cfu/ml时，α-葡萄糖苷酶活性分别为76.97
±
4.95％、68.16
±
2.59％和58.96
±
2.48％，与空白组(100.00
±
6.90％)相比均差异性显著(p《0.01)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，唾液乳杆菌lf01对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均强于弯曲乳杆菌lc02和罗伊氏乳杆菌e8。
[0058]
实施例4唾液乳杆菌lf01降低高血糖斑马鱼体内的葡萄糖含量
[0059]
葡萄糖试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。
[0060]
模型构建：将野生型ab系斑马鱼(5dpf)置于于六孔板中。实验设置正常组、模型组、阳性对照组(阿卡波糖)、菌株干预组(1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml唾液乳杆菌lf01)，每组设置6个复孔，每孔10条鱼，用蔗糖(4％)与四氧嘧啶(1mmol/l)联合处理斑马鱼(5dpf)48h后构建高血糖斑马鱼模型。
[0061]
干预：正常组和模型组每孔加入5ml pbs；阳性对照组每孔加入5ml0.05mg/ml阿卡波糖溶液；1
×
104cfu/ml干预组加入1
×
104cfu/ml唾液乳杆菌lf01，1
×
105cfu/ml干预组加入1
×
105cfu/ml唾液乳杆菌lf01，1
×
106cfu/ml干预组加入1
×
106cfu/ml唾液乳杆菌lf01，每孔5ml，28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育48h后收集斑马鱼至1.5ml离心管，每管5条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入100μl的乙醇，用s-18ks手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，12000
×
g，4℃离心10min，收集上清液于离心管中，转移至烘箱70℃1小时烘干。每管加入5μl的超纯水，温度37℃，摇床转速200r/min，15min后，取其中2μl，使用葡萄糖试剂盒检测上清液中葡萄糖的浓度(a)。降糖率计算如下：
[0062][0063]
采用spss 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x
±
sd数据表示，用单因素方差分析。与正常组相比：
###
p《0.005；与模型组相比：**p《0.01，***p《0.005。
[0064]
结果见图5和图6；由图5可知，与正常组(1.14
±
0.15nmol/fish)相比，模型组的斑马鱼体内葡萄糖含量(4.01
±
0.34nmol/fish)显著增加(p《0.005)，说明本次斑马鱼糖尿病模型建立成功。
[0065]
由图5和图6可知，阿卡波糖组斑马鱼体内葡萄糖含量为1.98
±
0.18nmol/fish，降糖率为70.84
±
6.42％，与模型组(4.01
±
0.34nmol/fish)相比差异性显著(p《0.005)。因
此，阿卡波糖具有降血糖的作用，与临床结果一致。唾液乳杆菌lf01浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml和1
×
106cfu/ml时，斑马鱼体内葡萄糖含量分别为3.37
±
0.16nmol/fish、3.22
±
0.24nmol/fish和2.47
±
0.36nmol/fish，同时降糖率分别为22.37
±
5.43％、27.54
±
8.22％和53.57
±
12.66％，与模型组(4.01
±
0.34nmol/fish)相比差异性显著(p《0.01)。因此，上述结果表明唾液乳杆菌lf01具有降血糖的功效。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。