犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用

1.本发明涉及生物干细胞技术领域在宠物眼科的应用，具体涉及一种犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用。


背景技术：

2.犬猫因角膜损伤而导致的泪目、眼分泌物增多、羞光、瘢痕组织修复困难等问题是宠物临床的常见问题，角膜损伤未能及时治疗修复而形成的瘢痕组织使宠物的视力大大减弱，而角膜损伤修复目前还未有十分有效的治疗方案。宠物使用阿托品、红霉素等滴眼液的宠物在停药后，炎症、溃疡症状会出现反弹，表现为角膜炎进展。而且阿托品/红霉素等滴眼液有很高的全身和局部不良反应发生率。因此亟需寻找更适合的眼部用药，以预防近视。
3.间充质成体干细胞(mesenchymal stem cells,msc)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，间充质干细胞用于组织修复或再生是近十年的研究热点，间充质干细胞分泌大量活性物质，包括生长因子(growth factor)、细胞因子(cytokine)和趋化因子(chemokine)、抗纤维化因子等，在损伤组织的修复过程中发挥重要作用，可促进细胞分裂，调节细胞代谢，影响细胞的形态、浸润、分化和衰老，对角膜的上皮细胞基质细胞核内皮细胞均可产生影响。因此，通过培养犬脂肪间充质干细胞，分离细胞培养上清液，并添加相关辅料等配制犬间充质干细胞因子滴眼液，并观察其对犬猫角膜损伤的修复效果。


技术实现要素：

4.本发明解决的问题在于提供一种犬成体干细胞活性因子及滴眼液的制备方法和应用，为进一步开发犬脂肪间充质干细胞的应用，延长有效保存时间，提高角膜损伤愈合的速度、本发明用的低传代的间充质干细胞(5代左右)，其分泌的活性成分多，采用专用的无血清培养基制备，比其他犬成体干细胞活性因子比起来没有免疫排斥和副作用。
5.为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：犬成体干细胞活性因子的制备方法步骤为：
6.1)用α-mem完全培养液培养传代从组织中分离的犬脂肪间充质干细胞；
7.2)当细胞生长密度到80～90％时，收集低传代犬脂肪间充质干细胞培养上清液，将收集的上清液无菌离心，弃沉淀取上清液，上清液超低温-80℃冻存备用；
8.3)将-80℃冻存的凝固体通过冷冻干燥机蒸发水分获取干粉，真空压力0.030mbar、-88℃、48h制得的犬成体干细胞活性因子，称重，锡纸包裹。
9.步骤1)的具体方法为：
10.(1)将组织块在α-mem中清洗，剪碎至1mm3的碎末状；
11.(2)吸取预先配好过滤后37℃预热的0.1％的i型胶原酶反复吹吸，最后全部吸入含胶原酶的50ml离心管中；
12.(3)将离心管管口用喷洒过酒精的封口膜封口后，将其置于37℃恒温水浴振荡器中消化1h，每隔10min上下反复颠倒离心管；
13.(4)1h后，用等量α-mem培养液中和胶原酶，反复吹吸使其完全中和后1000rpm，5min离心，用来分离成熟的脂肪组织；
14.(5)弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，用20mlα-mem细胞培养液冲起，吹打均匀后，经100μm滤网过滤后1000rpm，5min常温离心；
15.(6)离心后弃去上层悬液，用1ml含5％ultragro
tm
(血清替代物)的α-mem培养液吹打均匀后移入6孔板，放入浓度5％co2，37℃恒温培养箱培养；
16.待细胞长成80～90％细胞融合后，用tryple express(胰酶替代物)消化细胞，待细胞彼此分离时弃去胰酶，用培养液重悬细胞，1:3传代培养得犬到脂肪间充质干细胞。
17.步骤2)的具体方法为：
18.待犬脂肪间充质干细胞生长接近80～90％融合，更换新鲜培养基，并进行传代培养，收集第3～5代的细胞培养上清液；
19.将上清液用无菌离心管1500rpm，离心10min，弃沉淀取上清液，-80℃超低温冰箱中预冻12-24h备用。
20.步骤3)的具体方法为：
21.将-80℃冻存凝固的犬脂肪间充质干细胞上清，真空度0.030mbar条件下冻干48～50h，除去冰晶，最后制得犬成体干细胞活性因子，-80℃保存。
22.一种带有犬成体干细胞活性因子的滴眼液的制备方法步骤为：
23.将硼酸、硼砂、hpmc注射无菌水加至100ml混合，搅拌至溶解，然后加入edta-2na和nacl，继续进行搅拌，搅拌速度为900-1200转/分钟、20分钟，定容后得到滴眼液初始溶液，静置1-2小时；调节ph值到7，制成间充质干细胞活性因子滴眼液稀释液，在使用前加入100ml的滴眼液稀释液中加入1g的犬成体干细胞活性因子充分搅拌溶解，搅拌速度为900-1200转/分钟、20分钟，然后使用0.22微米无菌型过滤器进行除菌过滤，即可。
24.犬成体干细胞活性因子在制备促角膜损伤愈合/伤口修复滴眼液药物中的应用。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
26.1)本发明将犬成体干细胞活性因子可以有效的延长保存时间；
27.2)本发明涉及犬成体干细胞活性因子可用于创伤修复作用。
28.3)本发明中的犬成体干细胞活性因子可以促进改善创伤局部微循环状态。
29.4)本发明所制备的犬成体干细胞活性因子有效保存了犬脂肪带间充质干细胞上清液中的各种具有生物活性的细胞因子混合物，可以有效地解决上清液的保存期，并且犬成体干细胞活性因子在-80℃保存可以维持长期有效。
30.5)本发明采用犬成体干细胞活性因子和滴眼液稀释液分别制备，使用时再制得滴眼液有效的保存了滴眼液中冻干粉中活性因子的效果，提高了角膜损伤伤口愈合的速度和质量。
附图说明
31.图1为msc与con组差异蛋白韦恩图；
32.图2为msc与con组差异蛋白表达热图；
33.图3为病例1治疗前后的对比图；
34.图4为病例2治疗前后的对比图。
具体实施方式
35.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.实施例：
37.犬成体干细胞活性因子的制备方法为：
38.本发明犬成体干细胞活性因子的制备方法，包括以下步骤：
39.1)用α-mem完全培养液培养传代从组织中分离的犬脂肪间充质干细胞；
40.2)当细胞生长密度到80～90％时，收集低传代犬脂肪间充质干细胞培养上清液，将收集的上清液无菌离心，弃沉淀取上清液，上清液超低温-80℃冻存备用；
41.3)将-80℃冻存的凝固体通过冷冻干燥机蒸发水分获取干粉，真空压力0.030mbar、-88℃、48h制得的犬成体干细胞活性因子，称重，锡纸包裹。
42.所述步骤1)的具体方法为：
43.(1)将组织块在α-mem中清洗，剪碎至1mm3的碎末状；
44.(2)吸取预先配好过滤后37℃预热的0.1％的i型胶原酶反复吹吸，最后全部吸入含胶原酶的50ml离心管中；
45.(3)将离心管管口用喷洒过酒精的封口膜封口后，将其置于37℃恒温水浴振荡器中消化1h，每隔10min上下反复颠倒离心管；
46.(4)1h后，用等量α-mem培养液中和胶原酶，反复吹吸使其完全中和后1000rpm，5min离心，用来分离成熟的脂肪组织；
47.(5)弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，用20mlα-mem细胞培养液冲起，吹打均匀后，经100μm滤网过滤后1000rpm，5min常温离心；
48.(6)离心后弃去上层悬液，用1ml含5％ultragro
tm
(血清替代物)的α-mem培养液吹打均匀后移入6孔板，放入浓度5％co2，37℃恒温培养箱培养；
49.待细胞长成80～90％细胞融合后，用tryple express(胰酶替代物)消化细胞，待细胞彼此分离时弃去胰酶，用培养液重悬细胞，1:3传代培养得犬脂肪间充质干细胞。
50.所述步骤2)的具体方法为：
51.待犬脂肪间充质干细胞生长接近80～90％融合，更换新鲜培养基，并进行传代培养，收集第3～5代的细胞培养上清液；
52.将上清液用无菌离心管1500rpm，离心10min，弃沉淀取上清液，-80℃超低温冰箱中预冻12-24h备用。
53.所述步骤3)的具体方法为：
54.将-80℃冻存凝固的犬脂肪间充质干细胞上清，真空度0.030mbar条件下冻干48～50h，除去冰晶，最后制得犬成体干细胞活性因子，-80℃保存。
55.上述制得的犬成体干细胞活性因子在制备促角膜损伤愈合/伤口修复滴眼液药物中的应用。
56.一种带有犬成体干细胞活性因子的滴眼液的制备方法为：
57.将0.35g硼酸、0.11硼砂、0.1g hpmc加注射无菌水调制成100ml溶液混合均匀，然后加入0.7nacl、0.01gedta-2na继续搅拌，搅拌速度为900-1200转/分钟、20分钟，定容后得
到滴眼液初始溶液，静置1-2小时，调节ph值到7，制成间充质干细胞活性因子滴眼液稀释液，在使用前加入1g犬成体干细胞活性因子，搅拌速度为900-1200转/分钟、20分钟，使用0.22微米无菌型过滤器进行除菌过滤，即得间充质干细胞活性因子滴眼液。
58.辅料中硼酸、硼砂为缓冲盐，提供较稳定的缓冲系统，氯化钠为渗透压调节剂，edta-2na能增强杀菌剂的活性以抵抗革兰氏阴性菌，hpmc为增稠剂。
59.本发明滴眼液有效性评价
60.蛋白组高通量测序：msc(本发明制得的犬成体干细胞活性因子)组与con(负液/对照组，无msc细胞)组测序分析，差异蛋白表达的聚类图结果如图1和2所示。根据图1可知，共有3364个蛋白差异表达，其中，在msc和con组都表达的差异蛋白的个数为778，336个差异蛋白只在con组中表达，2250个差异蛋白只在msc组中表达。根据图2可知，msc组与con组相比，胶原蛋白家族的f1phy1和f1q3i5的表达明显上调，相比于正常细胞的表达量上调大于50倍以上，使本发明特定的方法制备的间充质干细胞培养上清液具有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，又有较好的平滑性和弹性。还高表达了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的a0a5f4c710、a0a5f4clc9和a0a5f4crw6，能与多种生长因子和趋化因子酶等蛋白发生相互作用，影响多种信号通路，参与所有器官系统的代谢、转运、信息传递、调节及结构维持，在器官发育中发挥着重要作用。
61.病例1
62.西北农林科技大学动物医院接诊1只1岁左右狸花猫，体重5kg，体况良好，到院时精神沉郁，检查可见其右眼角膜有明显病变，角膜部位存在较大面积白翳，遮挡瞳孔，且表面有明显毛细血管生成，向视轴蔓延。角膜表面未见有异物，睫毛生长正常，眼睑正常，角膜未见异常突出，如图3左图所示。威吓试验阴性，瞳孔对光反射阴性，荧光素钠反应阳性。主诉发现该猫有抓挠右眼的行为，故而发现其眼睛变化，至就医时未进行处理。根据症状判断病因为单纯擦伤，诊断为角膜炎并发血管翳。
63.采用本发明滴眼液给药10天后，该猫右眼角膜溃疡愈合，白翳近乎消失，瞳孔重现，威吓试验阳性，瞳孔对光反射阳性，荧光素钠反应弱阳性，原角膜区域内的毛细血管也消失，角膜透明度明显提高，如图3右图所示。该猫抓挠眼睛频率降低，治疗效果良好。
64.病例2
65.一的宠物医院接收一只两月龄左右蓝猫，体重1kg，到院时可见其精神沉郁，体型瘦小，提示营养不良或贫血。左眼可见明显损伤，眼睑红肿，无法正常闭合，眼周存在炎性分泌物，毛发粘连，角膜浑浊增厚呈淡黄色，未见异物和角膜突出，如图4左图所示。威吓试验阴性，瞳孔对光反射阴性，荧光素钠反应阳性。主诉该猫是捡到的流浪猫。根据症状怀疑其角膜损伤后继发感染。
66.采用本发明滴眼液给药10天后，眼睑肿大得到改善，眼周炎性分泌物消失，炎症得以抑制，角膜透浑浊有所改善但并未完全恢复，提示损伤严重，可能伤及角膜深层结构，如图4右图所示，威吓试验阴性，瞳孔对光反射阳性，荧光素钠反应弱阳性。
67.本发明为犬成体干细胞活性因子的临床及产业化应用奠定了基础，为犬成体干细胞活性因子的临床和产业化应用提供了基础和科学依据。