工程化CAS12B效应蛋白及其使用方法与流程

本技术总体上涉及生物。更具体地，本技术涉及具有提高的活性(例如，基因编辑活性)或消除的核酸酶活性的工程化cas12b效应蛋白和工程化的grna支架及其使用方法。

背景技术：

1、基因组编辑在基因组研究和各种应用中是重要且有用的技术。各种可用于基因组编辑系统，包括规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)-cas系统、转录激活子样效应物核酸酶(talen)系统，以及锌指核酸酶(zfn)系统。

2、crispr-cas系统是一种高效且具有成本效益的基因组编辑技术，广泛适用于从酵母和植物到斑马鱼和人类的一系列真核生物(由vanderoost,2013《科学(science)》339:768-770，以及charpentier和doudna,2013《自然(na ture)》495:50-51综述)。crispr-cas系统通过采用cas效应蛋白和crispr rna(crrna)的组合来在古细菌和细菌中提供适应性免疫。迄今为止，根据系统的显著功能和进化模块性，已经对包括六种类型(i至vi型)的两个类别(1类和2类)的crispr-cas系统进行了表征。在2类crispr-cas系统中，ii型ca s9系统和v-a/b/e/j型cas12a/cas12b/cas12e/cas12f/cas12j系统已经被用于基因组编辑，并且为生物医学研究提供了广阔的前景。

技术实现思路

1、当前的crispr-cas系统有各种局限性，包括有限的基因编辑效率。本技术提供了改进的方法和系统，用于跨多基因组位点的有效基因组编辑。特别地，在此提供了具有提高的酶活性的工程化cas12b核酸酶、工程化cas12b效应蛋白，包含工程化支架的工程化grna(例如sgrna和tracrrna)，以及(诸如在基因编辑中)使用工程化cas12b效应蛋白和/或工程化grna的方法。在一个方面，本技术提供了工程化cas12b核酸酶，其包含相对于参考cas12b核酸酶的一种、两种，或三种类型的突变，其中所述突变包含：(1)用带正电荷的氨基酸残基(例如r、h、k)取代参考cas12b核酸酶中与前间区序列邻近基序(pam)相互作用的一个或多个氨基酸残基；和/或(2)用具有芳环的氨基酸残基(例如f、y、w)取代参考cas12b核酸酶中参与打开dna双链(dsdna)的一个或多个氨基酸残基；和/或(3)用带正电荷的氨基酸残基(例如r、h、k)或疏水性氨基酸残基(例如f、y、w)取代参考cas12b核酸酶的ruvc结构域中与单链dna(ssdna)底物相互作用的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，参考cas12b核酸酶是野生型cas12b核酸酶。在一些实施方案中，参考cas12b核酸酶是来自alicyclobacillusacidiphilus的cas12b核酸酶(aacas12b)。在一些实施方案中，参考cas12b核酸酶包含seq id no:1的氨基酸序列。

2、在根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基取代参考cas12b核酸酶中与pa m相互作用的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，与pam相互作用的一个或多个氨基酸残基在三维结构中与pam的距离在10(例如9、8、7、6、5、4、3、2、1或更少)埃内。在一些实施方案中，与pam相互作用的一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：116、123、130、132、144、145、153、173、222、395、400和475。在一些实施方案中，与pam相互作用的一个或多个氨基酸残基包含以下氨基酸残基中的一个或多个：d116、k123、d130、d132、n144、k145、e153、d173、q222、d395、n400，和/或e475。在一些实施方案中，与pam相互作用的一个或多个氨基酸残基包含以下氨基酸残基中的一个或多个：d116和e475。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基是r或k。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含以下取代中的一种或多种：d116r和e475r。在一些实施方案中，氨基酸残基根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化的cas12b核酸酶包含seq id no:2或3的氨基酸序列。

3、在根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含用具有芳环的氨基酸残基取代参考cas12b核酸酶中参与打开dna双链的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，参与打开dn a双链的一个或多个氨基酸残基与pam中相对于靶链3'端的最后碱基对相互作用。在一些实施方案中，参与打开dna双链的一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：118和119。在一些实施方案中，具有芳环的氨基酸残基是y、f，或w。在一些实施方案中，所述用具有芳环的氨基酸残基取代参考cas12b核酸酶中参与打开dna双链的一个或多个氨基酸残基包含q119y、q119f或q119w。在一些实施方案中，所述氨基酸残基根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化cas12b核酸酶包含seq id no:4至6的氨基酸序列。

4、在根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基或疏水性氨基酸残基取代参考cas12b核酸酶中位于ruvc结构域中并与单链dna底物相互作用的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，位于ruvc结构域中并与单链dna底物相互作用的一个或多个氨基酸残基在三维结构中与单链dna底物的距离在10(例如9、8、7、6、5、4、3、2、1或更少)埃内。在一些实施方案中，位于ruvc结构域中并与单链dna底物相互作用的一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：300、301、304、329、636、639、647、682、757、758、761、764、768、852、854、856、857、858、860、862、863、865、866、867、869、938、956、957、958、994、1093和1097。在一些实施方案中，位于ruvc结构域中并与单链dna底物相互作用的一个或多个氨基酸残基包含以下氨基酸残基中的一个或多个：d300、k301、e304、n329、e636、q639、t647、q682、i757、e758、e761、e764、k768、e852、q854、n856、n857、d858、p860、s862、e863、n865、q866、l867、q869、e938、e956、g957、e958、i994、q1093和w1097。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基取代以下氨基酸残基中的一个或多个：e636、q639、t647、q682、i757、e758、e761、k768、q854、n857、d858、n865、q866、i994、q1093和w1097。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基是r或k。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含以下取代中的一种或多种：e636r、q639r、t647r、q682r、i757r、e758r、e761r、q854r、n857k、d858r、i994r、q1093r和w1097r。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含用疏水性氨基酸残基取代以下氨基酸残基中的一个或多个：e758、e761、e863、n865、q866、q869、q956和q1093。在一些实施方案中，疏水性氨基酸残基是w、y、f，或m，诸如w、y或m。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含以下取代中的一种或多种：n865w、n865y、q866m、q869m、q1093w和q1093y。在一些实施方案中，氨基酸残基根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化的ca s12b核酸酶包含如seq id no:7至19中任一项所述的氨基酸序列。

5、在根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含以下取代中的任一种或其组合：(1)d116r；(2)e475r；(3)q119f和e475r；(4)q119f、e475r，以及e758r；(5)q119y；(6)q119f；(7)q119w；(8)i757r；(9)e758r；(10)e761r；(11)k768r；(12)i757r和e758r；(13)i757r和e761r；(14)i757r和k768r；(15)e758r和e761r；(16)e758r和k768r；(17)e761r和k768r；(18)i757r、e758r，以及e761r；(19)i757r、e758r，以及k768r；(20)i757r、e761r，以及k768r；(21)e758r、e761r，以及k768r；(22)i757r、e758r、e761r，以及k768r；(23)q866m；(24)q869m；以及(25)q866m和q869m；(26)e636r；(27)q854r；(28)n857k；(29)n865w；(30)n865y；(31)q1093w；(32)q1093y和(33)d858r；而其中氨基酸残基根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化的cas12b核酸酶包含下述取代中的任一项或其组合：(1)q866m+q869m；(2)q119f+e475r；及(3)q119f+e475r+e758r；且其中所述氨基酸残基根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化cas12b核酸酶包含如seqidnos:20至22中任一项所述的氨基酸序列。

6、在根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含与seq id no:2至seq id no:22中的任一个具有至少约85％(88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶包含(或由下述组成，或基本上由下述组成)seq id no:1至seq id no:22中的任一个的氨基酸序列。

7、在根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶还包含增加柔性区域的柔性的一种或多种突变，所述柔性区域包含氨基酸残基855至859。在一些实施方案中，增加柔性的一种或多种突变包含n856g。在一些实施方案中，所述氨基酸位置根据seq id no:1编号。

8、本技术的一个方面提供了工程化cas12b核酸酶，其包含以下突变中的任一个或多个：(1)d116r；(2)e475r；(3)q119f+e475r；(4)q119f+e475r+e758r；(5)q119y；(6)q119f；(7)q119w；(8)i757r；(9)e758r；(10)e761r；(11)k768r；(12)i757r+e758r；(13)i757r+e761r；(14)i757r+k768r；(15)e758r+e761r；(16)e758r+k768r；(17)e761r+k768r；(18)i757r+e758r+e761r；(19)i757r+e758r+k768r；(20)i757r+e761r+k768r；(21)e758r+e761r+k768r；(22)i757r+e758r+e761r+k768r；(23)q866m；(24)q869m；(25)q866m+q869m；(26)e636r；(27)q854r；(28)n857k；(29)n865w；(30)n865y；(31)q1093w；(32)q1093y；和(33)d858r；且其中氨基酸位置根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化的cas12b核酸酶包含下述取代的任一项或其组合：(1)q866m+q869m；(2)q119f+e475r；和(3)q119f+e475r+e758r；且其中所述氨基酸残基根据seq id no:1编号。在一些实施方案中，所述工程化cas12b核酸酶包含下述取代：q119f+e475r+e758r；且其中所述氨基酸残基根据seqidno:1编号。

9、本技术的一个方面提供了工程化cas12b核酸酶，其与seq id no:2至22的任一个具有至少约85％(例如至少约88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性，或者包含seq id no:2至seq id no:22中的任一个的氨基酸序列。

10、本技术的一个方面提供了包含根据上述工程化cas12b核酸酶中的任一种的工程化cas12b核酸酶或其变体或其功能性衍生物的工程化cas12b效应蛋白。在一些实施方案中，工程化cas12b核酸酶或其功能性衍生物具有酶活性。在一些实施方案中，工程化cas12b效应蛋白能够诱导dna分子中的双链断裂。在一些实施方案中，工程化cas12b效应蛋白能够诱导dna分子中的单链断裂。在一些实施方案中，工程化cas12b效应蛋白包含工程化cas12b核酸酶的酶失活突变体。在一些实施方案中，所述工程化cas12b核酸酶的酶失活突变体包含选自下组的一个或多个氨基酸残基的取代：d570a、e848a、r785a、e848a、r911a，和d977a，并且其中所述氨基酸残基根据seqidn o:1编号。在一些实施方案中，所述工程化cas12b核酸酶的酶失活突变体包含(或由下述组成，或基本上由下述组成)seq id no:79至81的任一项的氨基酸序列，或者其与seq id no:79至81的任一个具有至少约85％(例如至少约88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的任一项)序列同一性的变体。

11、在根据上述工程化cas12b效应蛋白中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b效应蛋白还包含融合至工程化cas12b核酸酶或其功能性衍生物的功能结构域。在一些实施方案中，所述功能结构域选自：翻译起始子结构域、转录阻遏子结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告子结构域，以及核酸酶结构域。在一些实施方案中，所述转录抑制结构域是krüppel-相关盒(krab)结构域，诸如包含seqidno:72的氨基酸序列。

12、在根据上述工程化cas12b效应蛋白中的任一种的一些实施方案中，工程化cas12b效应蛋白包含第一多肽和第二多肽，第一多肽包含工程化cas核酸酶或其功能性衍生物的n末端部分，第二多肽包含工程化cas核酸酶或其功能性衍生物的c末端部分，其中第一多肽和第二多肽能够在包含指导序列的指导rna的存在下彼此缔合以形成特异性结合至包含与指导序列互补的靶序列的靶核酸的crispr复合物。在一些实施方案中，工程化cas12b效应蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含工程化cas12b核酸酶或其功能性衍生物的n末端氨基酸残基1至x，其中第二多肽包含工程化cas12b核酸酶或其功能性衍生物的x+1残基至c末端,其中第一多肽和第二多肽能够在含有指导序列的指导rna的存在下彼此缔合以形成特异性结合至靶核酸的cris pr复合物，其中该靶核酸包含与指导序列互补的靶序列。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含二聚化结构域。在一些实施方案中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域在诱导物的存在下彼此缔合。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽不包含二聚化结构域。

13、本技术的另一方面提供了一种单指导rna(sgrna)，其包含如seq idno:25至53中任一项所述的序列。

14、本技术的另一方面提供了工程化crispr-cas12b系统，其包含：(a)根据上述工程化cas12b核酸酶中任一项所述的工程化cas12b核酸酶或者根据上述工程化cas12b效应蛋白中的任一种的工程化cas12b效应蛋白，或其编码核酸；和(b)包含与靶核酸的靶序列互补的指导序列的指导rna，或编码该指导rna的核酸，其中工程化cas12b效应蛋白和指导rna能够形成特异性结合至所述包含靶序列的靶核酸的crispr复合物并诱导靶核酸的修饰。在一些实施方案中，指导rna包含crrna和tracrrna。在一些实施方案中，工程化crispr-cas12b系统包含编码多个crrna的前体指导rna阵列。在一些实施方案中，指导rna是单指导rna(sgrna)。在一些实施方案中，所述sgrna包含如seq id no:23至53中任一项所述的序列。在一些实施方案中，工程化crispr-cas12b系统包含编码所述工程化cas12b核酸酶或所述工程化cas12b效应蛋白的一种或多种载体。在一些实施方案中，该一种或多种载体是腺相关病毒(aav)载体。在一些实施方案中，aav载体还编码指导rna。

15、本技术的另一方面提供了一种工程化crispr-cas12b系统，其包括：(a)根据上述工程化cas12b核酸酶中任一项的工程化cas12b核酸酶，或根据上述工程化cas12b效应蛋白中任一项的工程化cas12b效应蛋白，该cas12b核酸酶或效应蛋白包含seq id no:1至22和79至81中任一项的氨基酸序列或其编码核酸；以及(b)grna，其包含与靶核酸或编码所述grna的核酸的靶序列互补的指导序列，其中所述grna包含工程化支架，所述工程化支架包含se q id no:25至53中任一项的序列；其中cas12b核酸酶(例如工程化的)或其效应蛋白和grna能够形成特异性结合靶核酸的crispr复合物并诱导靶核酸的修饰。在一些实施方案中，所述grna包含crrna和tracrrna，并且其中tracrrna包含工程化支架或其部分。在一些实施方案中，所述工程化的cris pr-cas12b系统包含编码多种crrna的前体grna阵列。在一些实施方案中，所述grna是sgrna。在一些实施方案中，所述工程化crispr-cas12b系统包含一种或多种编码工程化cas12b核酸酶或其效应蛋白、或cas12b核酸酶或其效应蛋白的载体。在一些实施方案中，所述一个或多个载体是aav载体。在一些实施方案中，所述一个或多个载体进一步编码所述grna。

16、本技术的一个方面提供了检测样品中的靶核酸的方法，其包括：(a)将样品与根据上述工程化crispr-cas12b系统中的任一种的工程化crispr-cas12b系统和带标记的检测核酸接触，其中所述grna包含与所述靶核酸的靶序列互补的指导序列，且其中带标记的检测核酸是单链的并且不与指导rna的指导序列杂交；和(b)测量由工程化cas12b核酸酶或其效应蛋白切割带标记的检测核酸而产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

17、本技术的一个方面提供了修饰包含靶序列的靶核酸的方法，其包含将靶核酸与根据上述工程化crispr-cas12b系统中的任一种的工程化crispr-ca s12b系统接触。在一些实施方案中，该方法在体外进行。在一些实施方案中，所述靶核酸存在于细胞中。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞，或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。在一些实施方案中，所述方法离体进行。在一些实施方案中，所述方法在体内进行。在一些实施方案中，所述靶核酸被切割。在一些实施方案中，通过工程化crispr-cas12b系统改变靶核酸中的靶序列。在一些实施方案中，通过工程化crispr-cas12b系统改变所述靶核酸的表达。在一些实施方案中，靶核酸是基因组dna。在一些实施方案中，所述靶序列与疾病或病症相关联。在一些实施方案中，工程化crispr-cas12b系统包含编码多个crrna的前体指导rna阵列，其中每个crrna包含不同的指导序列。

18、本技术的另一方面提供了治疗与个体的细胞中的靶核酸相关联的疾病或病症的方法，其包含使用根据上述工程化crispr-cas12b系统中的任一种的工程化crispr-cas12b系统修饰个体的细胞中的靶核酸，从而治疗所述疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自：癌症、心血管疾病、遗传疾病、自身免疫疾病、代谢疾病、神经变性疾病、眼病、细菌感染，以及病毒感染。

19、还提供了包含经修饰的靶核酸的工程化细胞，其中已经使用根据上述修饰靶核酸的方法中的任一种的方法修饰了靶核酸)。还提供了工程化非人动物，该工程化非人动物包含其一种或多种工程化细胞。

20、还提供了用于上述方法中的任一种的组合物、试剂盒，以及制品。

21、应当理解，为了清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独或以任何合适的子组合提供。与特定方法步骤、试剂，或条件，或组合物的组分有关的实施方案的所有组合均被本公开具体地涵盖并且在本文中公开，就如同每个和每种组合被单独和明确地公开一样。