一种二硫化四甲基秋兰姆降解菌株及其筛选方法与应用

1.本发明属于微生物修复技术领域，具体涉及一种胶清废水中二硫化四甲基秋兰姆降解菌株及其筛选方法与应用。


背景技术：

2.二硫化四甲基秋兰姆（tmtd）在农业上用作种子杀菌剂、杀虫剂、防霉剂，在工业上用作润滑油添加剂，同时是天然橡胶、合成橡胶及乳胶用的超硫化促进剂。二硫化四甲基秋兰姆（tmtd）也常与噻唑类促进剂并用，尤其也可与其他促进剂并用作为连续胶料的促进剂，使得胶料制品的老化性和耐热性极好，因此也能够用于制造轮胎、内胎、胶鞋、医疗用品、电缆和工业制品等，主要适用于透明、白色和有色的橡胶工业制品。同时，二硫化四甲基秋兰姆（tmtd）也能在氯丁橡胶中用作硫化延缓剂。
3.2021年中国天然橡胶需求量为594.9万吨，同比增长98.30%，占全球总消费的42.25%，目前我国已成为全球最大天然橡胶消费国，而我国近一半的天然橡胶生产来自热带地区的海南省。在橡胶初加工行业中，每生产1 t橡胶制品约产生废水40~45 m3，这些废水中包括脱脂乳浆液（sls），脱脂乳浆液（sls）是在酸性淡黄色废水的固化阶段加入硫酸后形成的浓乳液。如果橡胶生产企业为了降低成本而直接排放未经处理的废水，会对附近的水、空气和土壤环境造成污染，并影响周围生态系统的正常运行。天然橡胶加工厂在生产过程中所产生的废水常当做常规的工业废水经过处理后直接排放河流，这些废水中就含有tmtd，而目前我们国家暂时并没有对tmtd有明确的规定限值，如果含有tmtd的水体被橡胶生产企业周边的农田用以灌溉，那么橡胶生产企业周边的农田土壤存在被橡胶初加工废水中tmtd的污染的风险，而上述tmtd所造成的土壤残留及污染常容易被人们所忽视。
4.橡胶初加工产业中鲜乳胶的保存关系到产品胶的质量，在鲜乳胶的复合保存体系中，目前我国橡胶行业推广的是nh3+tt/zno复合保存体系，该体系中tmtd的添加量一般在胶乳的0.01%左右。而tmtd属于中等毒性杀菌剂，在橡胶初加工生产中常作硫化促进剂， tmtd吸入会引起动物的心肺和其他器官严重破坏甚至中毒，严重可危及到生命，同时对人体的黏膜及皮肤都有刺激作用，也是儿童重要的过敏来源。
5.目前，成熟的脱脂乳浆液（sls）处理方法有很多，如曝气、混凝、膜技术、厌氧消化等。常规处理方式主要为化学氧化和催化氧化工艺，其工艺主要是降低toc的含量，但是实际运行时成本高，且对于tmtd的处理并不相关，也缺少对脱脂乳浆液（sls）中tmtd污染土壤的危害和处理方法的关注。近年来，随着生物工程技术的不断发展，利用微生物的降解作用修复土壤效率高效、操作简便及低廉的价格使得微生物对有机污染物降解已是土壤环境修复中的一个重要内容，生物修复依然成为解决土壤有机污染物残留问题的热点研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种胶清废水中二硫化四甲基秋兰姆降解菌株，及其筛选方法与应用，以弥补现有技术的不足。
7.本发明通过对天然橡胶初加工废水污染土壤的实地调研，从橡胶初加工厂周边污染土壤中不断筛选、驯化出能够降解污染土壤的胶清废水中tmtd的优势菌种，研究高效降解菌株的不同条件下的生长情况，并明确菌株的最佳降解条件并进行模拟降解试验，验证该优势菌株的实际降解应用效果。试验结果实验结果为菌株的实际开发应用提供了初步理论依据。为被胶清废水中tmtd污染的土壤提供一个简单易行且低成本处理且如何科学正确使用tmtd、有效的提高天然橡胶初加工产品质量，减小对环境影响的新思路。
8.为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：一种二硫化四甲基秋兰姆降解菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏号为：gdmcc no:62773，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，广东省科学院微生物研究所，保藏日期为2022年9月8日，邮编：510070；分类学名称为：enterobacter bugandensis，菌株命名为：tmtd-9。
9.所述二硫化四甲基秋兰姆降解菌株tmtd-9的分类学为：细菌界（bacteria）；变形菌门（proteobacteria）；肠杆菌目(enterobacteriales)；γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)；肠杆菌科(enterobacteriaceaes）；布甘地肠杆菌属（enterobacter bugandensis）。
10.所述二硫化四甲基秋兰姆降解菌株tmtd-9通过生物扫描电子显微镜（sem）扫描发现，该菌株中等大小，菌体的形态多数呈直杆状，也有的菌体微弯；菌体两端呈钝圆形，较短而粗壮，排列较紧密存在，无一定排列形式 ，大体呈“i”字形字样；细胞壁为革兰氏阴性结构；在lb培养基上培养36 h后形成条形、表面微隆起且光滑圆润，有光泽且黏连在一起的黄白色的菌落。
11.进一步地，所述二硫化四甲基秋兰姆降解菌株tmtd-9菌株温度适应范围为10~40 ℃，ph适应范围为5~9。其最佳tmtd降解温度为30 ℃，ph=7；降解胶清废水中的tmtd的浓度为198 mg/l。
12.所述二硫化四甲基秋兰姆降解菌株tmtd-9的筛选方法，包括以下步骤：1）采集橡胶初加工厂废水流经周边地面0-20 cm处的土壤，取干燥过筛后的供试土壤样品；2）将供试土壤样品置于无机盐培养基中进行培养，培养7 d后取出锥形瓶静置弃去上清液；3）每隔7 d为一个周期，重新加入tmtd无机盐培养液，重复步骤2）并且以一定的浓度梯度提高tmtd的浓度，最终是培养液中tmtd的浓度最终为250 mg/l.如此将样品驯化五个周期以上，进行转待培养；4）从富集培养基中取1 ml悬液，采用稀释平板法用于固体培养基上培养，胶清废水为唯一氮源；5）从步骤4）中分别挑取形态良好的菌株进行平板划线纯化培养；6）重复步骤5）操作，直至选出长势良好且稳定的的tmtd-9菌种，保存在-4 ℃冰箱中。
13.优选地，步骤2）中，1 g供试土壤样品对应无机盐培养基的体积为20 ml；步骤2）中，所述培养为震荡培养，所述的震荡培养条件为：温度为30 ℃、转速为150 rpm、时间为7 d。
14.优选地，步骤4）中，所述培养为恒温培养箱培养，培养至菌落长出的培养条件温度为30℃；步骤4）中，富集过程的lb培养基以胶清废水为唯一氮源。
15.优选地，步骤5）中，所述的平板划线的固体培养基为步骤4）的以胶清废水为唯一氮源的lb培养基制备中加入琼脂粉。
16.进一步的，所述无机盐培养基（g/l）的制备方式：mgso4˙
7h2o0.2gk2hpo40.1gfeso4˙
7h2o0.001gcaso40.04g(nh4)2so40.1gph7.0，高压蒸汽灭菌1.5h。
17.所述lb培养基（g/l）的制备方式：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，nacl5.0g，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌1.5h。
18.固体培养基（g/l）的制备方式：酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，nacl5.0g，5.0g琼脂，ph7.0，高压蒸汽灭菌1.5h。
19.所述二硫化四甲基秋兰姆降解菌株tmtd-9在降解二硫化四甲基秋兰姆（tmtd）中的应用。
20.本发明的优点和技术效果：本发明针对胶清废水进行菌株筛选，筛选出来的tmtd-9菌株对于胶清废水中的tmtd具有良好的降解性能。菌株tmtd-9具有广泛的温度、ph的适应范围；其最佳降解条件为温度30℃、ph=7，降解胶清废水中的tmtd的浓度为198mg/l。
21.本发明在胶清废水分离纯化得到tmtd降解菌株tmtd-9，且经过验证，该菌株能够有效降解土壤中tmtd含量。基于本发明未来的研究可考虑在土壤原生动物、植物作用下进行，以更好地阐明胶清废水中tmtd对农业土壤环境中各因素结构的影响，这将更好地评估胶清废水中tmtd对土壤的生态环境效应，为未来的可持续土地修复利用指明了一个非常有前景的方向。
附图说明
22.图1为本发明的胶清废水中tmtd降解菌株tmtd-9的菌落形态图。
23.图2为本发明的胶清废水中tmtd降解菌株的生物扫描电子显微镜（sem）图，其中图中：a：10μm微镜下菌株tmtd-9微观结构图；b：5μm微镜下菌株tmtd-9微观结构图。
24.图3为本发明的胶清废水中tmtd降解菌株tmtd-9的系统发育树。
25.图4为本发明的胶清废水中tmtd降解菌株tmtd-9对于含tmtd胶清废水污染土壤的模拟降解结果的降解率示意图。
具体实施方式
26.下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，基于本发明中的实施例，本领域普通技术然预案所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.下面将参考附图对本发明进行详细说明，说要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例以及实施例中的特征是可以相互结合的。
28.下述实施例中所用到的试剂及材料，无特殊说明，均可从商业渠道获得。
29.下述实施例中所用到的仪器设备，无特殊说明，均为本领域常规使用仪器设备。
30.实施例1：本实施例的胶清废水于2021年8月24日采集自中国海南省。
31.一种二硫化四甲基秋兰姆降解菌株的筛选方法，包括以下步骤：（1）采集海南省某橡胶初加工厂废水流经周边地面0-20cm处的土壤，取干燥过筛后的供试土壤样品；（2）将供试土壤样品置于无机盐培养基中进行培养，培养7d后取出锥形瓶静置弃去上清液，1g供试土壤样品对应无机盐培养基的体积为20ml；所述培养为震荡培养，所述的震荡培养条件为：温度为30℃、转速为150rpm、时间为7d；（3）每隔7d为一个周期，重新加入tmtd无机盐培养液，重复步骤2）并且以一定的浓度梯度提高tmtd的浓度，最终是培养液中tmtd的浓度最终为250mg/l.如此将样品驯化五个周期以上，进行转待培养；（4）从富集培养基中取1ml悬液，采用稀释平板法用于固体培养基上培养，胶清废水为唯一氮源；所述培养为恒温培养箱培养，培养至菌落长出的培养条件温度为30℃，富集过程的lb培养基以胶清废水为唯一氮源；（5）从步骤（4）中分别挑取形态良好的菌株进行平板划线纯化培养，所述的平板划线的固体培养基为步骤（4）的以胶清废水为唯一氮源的lb培养基制备中加入琼脂粉；（9）重复步骤（5）操作，直至选出长势良好且稳定的菌种（即为保藏的tmtd-9），保存在-4℃冰箱中。
32.上述方法中，胶清废水中二硫化四甲基秋兰姆降解菌株tmtd-9的筛选方法中，各培养基的制备方法：无机盐培养基（g/l）mgso4˙
7h2o0.2gk2hpo40.1gfeso4˙
7h2o0.001gcaso40.04g(nh4)2so40.1gph7.0，高压蒸汽灭菌1.5h。
33.lb培养基（g/l）蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，nacl5.0g，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌1.5h。
34.固体培养基（g/l）酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，nacl5.0g，5.0g琼脂，ph7.0，高压蒸汽灭菌1.5h。
35.实施例2：实施纯化菌种（tmtd-9）的鉴定：将纯化获得的菌株tmtd-9进行19srdna扩增，通过选择合适的引物序列基于聚合酶链式反应（pcr）技术进行dna扩增，使目的dna得以迅速扩增；选用细菌19srdna通用引物，经pcr扩增的目的片段，引物序列为：27f:agagtttgatcctggctcag1492r:ggttaccttgttacgactt在20μl反应体系中加入0.5μl上述dna模板，2μl的10
×
extaqbuffer缓冲液，1μl上下游引物，0.2μl的5uextaq聚合酶及1.9μldntp，pcr反应体系，先置95℃预变性5min,再按95℃30s、95℃30s、72℃1min30s设置25个循环，最后于72℃延伸10min；pcr反应条件以及检测电泳，取5μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物分析，纯化
和回收pcr产物， 通过凝胶电泳进行分离纯化和核酸鉴定。
36.菌种鉴定方法sanger测序对高效降解tmtd的菌株进行鉴定；所得序列在美国国立生物技术信息中心（ncbi）上进行blast比对，可通过在 ncbi 网站 ( www.ncbi.nlm.nih.gov )上访问的程序对 dna 序列进行分析。利用mega-7软件采用邻接（nj）法构建发育树（如图3所示）。比对分析结果鉴定菌株和enterobacter bugandensis strain bt23a2 （mw195538.1:1-1371）同源性相似度高达99%，所以菌株tmtd-9鉴定为enterobacter bugandensis。
37.根据系统发育树可知，胶清废水中tmtd降解菌株tmtd-9的分类学为：细菌界（bacteria）；变形菌门（proteobacteria）；肠杆菌目(enterobacteriales)；γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)；肠杆菌科(enterobacteriaceaes）；布甘地肠杆菌属（enterobacter bugandensis）。
38.单菌株的性质：菌株tmtd-9在lb培养基上培养39h后形成条形、表面微隆起且光滑圆润，有光泽且黏连在一起的黄白色的菌落（如图1所示）。通过生物扫描电子显微镜（sem）扫描发现，该菌株中等大小，菌体的形态多数呈直杆状，也有的菌体微弯。菌体两端呈钝圆形，较短而粗壮，排列较紧密存在，无一定排列形式 ，大体呈“i”字形字样，（图2（a、b）），细胞壁为革兰氏阴性结构。
39.采用电镜进行菌体形态学观察方法具体为，生物扫描电子显微镜（sem） 所用型号： 电镜：日立su8010 能谱：oxford x-max 80 临界点干燥仪：德国莱卡 cpd300；菌株在液体培养基中经恒温摇床（30 ℃，200 rpm）39 h活化后通过2.5%戊二醛溶液进行固定后，使用生物扫描电子显微镜（sem），用来观察细胞外表面的变形以及分布情况等，也可以观察材料在细胞表面的分布情况。
40.实施例3：胶清废水中二硫化四甲基秋兰姆降解菌株的降解的应用实例：称取供试降解模拟实验土壤（取自海南大学试验基地）。按比例加入含tmtd的橡胶初加工废水，使土壤处于好氧状态，搅拌均匀，进行模拟降解实验，加入经过活化按照1%（v/v）接种量驯化筛选的耐受菌株菌液，定期取样，采用hlcp法测定胶清废水中tmtd的浓度。
41.tmtd-9菌株对在土壤环境中的橡胶初加工废水中tmtd的降解，如图4所示，其中图4中：横坐标为降解时间，纵坐标为胶清废水中tmtd降解菌株tmtd-9对于被胶清废水污染土壤中tmtd的降解效率；ck为对照组，不加菌株tmtd-9，tmtd-9为实验组以3%的投加比（v/m）加入od900值为1.0的胶清废水中tmtd降解菌株tmtd-9菌悬液。
42.以未添加菌株tmtd-9作为对照。在第1d时，菌株tmtd-9细胞数量处于一个平稳状态，对于体系中的tmtd作用不为明显；到第3d开始，随着时间的推移，体系中细胞数量大量增加后，tmtd残留量虽有明显减少，tmtd的降解率明显提高。但由于tmtd初始浓度较高，从降解率上表现出和空白组的差异相对比不是很明显，第3d时，ck组的降解率仅仅为17.593%，而添加菌株tmtd-9的实验组的降解率此时为45.895%，说明菌株tmtd-9已经进行了“工作”；在降解模拟试验第7 d时，菌株tmtd-9对土壤环境中的橡胶初加工废水中tmtd的降解率已经达到了99.509%,基本已经完全降解，而ck组的降解率只有39.012%；在第14d时，菌株tmtd-9对土壤环境中的橡胶初加工废水中tmtd已经是完全降解，而ck对照组的仅有
58,923%。综上所述，tmtd-9菌株对于在土壤环境中残留的胶清废水中tmtd的降解的作用是快速且很有成效的。
43.胶清废水中tmtd的测定方案：用hlcp法测定胶清废水中tmtd的浓度，hlcp测定测定胶清废水中tmtd浓度的参数设定如下：色谱柱：agilent zo rbax sb-c18 (150
×
4.9 mm，5μm)；流动相：甲醇-水（40∶60），流速：1.0 ml/m ；柱温：30 ℃；检测波长：283 nm；进样量：20 μl；等度淋洗。
44.胶清废水中tmtd降解率的计算方法如下：本实施例所有处理均设置3个重复。菌株对橡胶初加工废水中tmtd的降解率以橡胶初加工废水中tmtd的初始浓度为据计算，计算得到菌株tmtd-9对胶清废水中tmtd-9的降解效率；计算公式如下：降解率(%)=(c
0-c
t
)/c0×
100%c0：橡胶初加工废水中tmtd的初始浓度；c
t
：降解了t时间橡胶初加工废水中tmtd的浓度。
45.所以分离筛选鉴定得到的tmtd高效降解菌tmtd-9，不仅生长适应的温度、ph等条件下范围较广，且在模拟降解实验中发挥稳定且有极好的降解能力。在7d左右对胶清废水中的tmtd的降解率达到99%以上。对含有tmtd胶清废水及含tmtd胶清废水污染了的土壤具有较好的应用前景，大幅度提高了胶清废水中tmtd的降解效率，具有良好的应用意义。
46.本发明提供了一种胶清废水中二硫化四甲基秋兰姆降解菌株及其筛选方法与应用，本领域人员可以借鉴本文内容进行适当改进技术参数实现。需要说明的是，尽管本说明书中已经对上述各实施例进行了描述，但是并非仅限制本发明的专利保护范围。所以基于本发明的该创新理念，对本说明书所述的实施例的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或者流程的变更，直接或间接的将上述技术方案运用在其他相关技术领域，均是本发明的专利保护范围之内。