肿瘤靶向的声动力锆基有机框架材料

1.本发明涉及一种肿瘤靶向的声动力锆基有机框架材料，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.金属有机框架材料是一种以金属簇为结点，通过与桥连有机配体以配位键方式连接的新型功能性材料。随着研究的发展，纳米级金属有机框架材料凭借其优良特性，如比表面积大，毒性低等，逐渐在医药领域占据一定的地位。合成纳米有机框架材料的方式主要包括超声法、溶剂热法、反向微乳法、机械化学法等，能够适合于大规模工业化生产。同时，该材料易于进行表面修饰，具备了无机材料和有机材料的各自优点。
3.近年来，金属有机框架材料逐渐在药物诊断和治疗方面崭露头角，据报道，多数的金属簇易与带有羧基，酚羟基等基团的有机配体进行桥连，形成具有稳定结构的框架材料。根据诊断或治疗的需求，选择合适的有机配体，主要包括非功能性配体和功能性配体，其共同特点为都具有均一合适的孔道，适用于负载诊断小分子，治疗性药物等。非功能性配体合成的纳米框架材料，主要作为药物载体，而功能性配体则赋予框架材料不同的特性，如荧光诊断或治疗特性。通过共价或非共价的方式结合靶向小分子，可使合成的框架材料特异性到达病灶，改善诊断的准确率和治疗的靶向效果，以及降低材料可能的毒副作用。
4.血卟啉单甲醚，一种fda批准使用的光敏剂小分子，被发现同时具有声敏剂特性，可用于肿瘤的声动力治疗，即在超声波刺激下，产生单线态氧，造成癌细胞的凋亡，但因其水溶性差以及副作用强等特性，限制了其更广泛的应用。目前，多数研究通过静电吸附等作用力将血卟啉单甲醚负载在多孔纳米材料内进行治疗性研究，但无法避免其在体内循环中的提前泄露问题。此外，血卟啉单甲醚作为一种卟啉衍生物，可利用其本身的荧光信号，进行体内的荧光成像检测。f3多肽作为一种广谱靶向药物，可以靶向多种癌细胞表面的核仁素，从而实现药物的定向累积，达到靶向肿瘤的效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种声动力锆基有机框架材料，结构稳定，可实现体内荧光成像监测。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.一种声动力锆基有机框架材料，其制备方法为：将氯化锆溶于甲醇/dmf的混合溶液中，记为溶液
①
，血卟啉单甲醚溶于dmf/三甲胺的混合溶液中，记为溶液
②
，将溶液
①
逐滴加入到溶液
②
，搅拌反应后，冰浴超声反应一段时间，然后于37℃搅拌过夜，获得锆基有机框架材料zr-hmme。
8.优选的，氯化锆与血卟啉单甲醚的质量比为3：1。
9.优选的，先搅拌反应20min再进行冰浴超声，冰浴超声的频率为40khz，时间在6h以上。
10.优选的，搅拌过夜后，分别用乙醇/dmf混合溶液、乙醇和去离子水清洗沉淀，获得
锆基有机框架材料zr-hmme。
11.优选的，甲醇/dmf的混合溶液中，甲醇与dmf的体积比为85：15；dmf/三甲胺的混合溶液中，dmf与三甲胺的体积比为50：1；乙醇/dmf混合溶液中，乙醇/dmf的体积比为85:15。
12.本发明还公开了一种修饰有马来酰亚胺基团的锆基有机框架材料，其制备方法为将py-paa-peg水溶液逐滴加入到上述的方法制得的zr-hmme溶液中，冰浴超声反应，得到修饰有马来酰亚胺基团的锆基有机框架材料zp。
13.优选的，py-paa-peg和zr-hmme的投入质量比为1:1。
14.优选的，冰浴超声反应的时间在2h以上，超声频率为40khz，冰浴超声完成后，通过离心的方式收集包覆有peg的锆基有机框架材料，并用去离子水清洗。
15.本发明还公开了一种肿瘤靶向的声动力锆基有机框架材料，其制备方法为将小分子多肽f3溶解在水溶液中，并加入tcep对多肽的巯基进行活化，逐滴加入zp水溶液进行反应，得到荷载f3的锆基有机框架材料zp-f3。
16.优选的，多肽f3与活化剂tcep的质量比为5：1，f3与zp的质量比为1：5。
17.本发明合成的金属有机框架材料具有靶向和声动力特性，尺寸可控，毒性低，且能够进行生物荧光成像，可以特异性结合不同类型肿瘤细胞，灵敏度高，可作为声敏剂使用，应用于肿瘤的诊断和治疗。该材料在肿瘤靶向给药、癌症诊断和治疗方面彰显出较强的优越性，为基于多功能生物材料的开发和设计提供有效的开发途径。
18.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
19.(1)本发明借助于声敏剂小分子血卟啉单甲醚和锆离子的稳定配位，利用超声法得到了性质稳定且荧光特性好的锆基有机框架材料，该设计方法简单易操作，适合大规模合成。
20.(2)本发明合成的材料具有良好的肿瘤靶向作用，可以作为靶向给药系统或可视化药物载体，安全可靠，在肿瘤的治疗领域具有非常广阔的应用前景。
21.(4)本发明的材料保留了有机配体血卟啉单甲醚的荧光和声动力特性，并减弱了有机配体的毒性，增加了其水溶性和生物相容性。
22.(5)本发明涉及材料表面进行有机分子修饰，例如聚乙二醇和小分子多肽，即zr-hmme可用芘-聚丙烯酸-聚乙二醇(py-paa-peg)进行表面修饰，偶联肿瘤靶向多肽f3。
23.(6)本发明所述的材料具有声动力刺激响应，并与小分子多肽f3形成靶向连接的药物输送系统，实现小鼠的体内荧光检测和肿瘤治疗。
附图说明
24.图1是利用动态光散射法(dls)测定的本发明的zp-f3的水合粒径图。
25.图2是本发明的zh(zr-hmme)和hmme的紫外可见分光光谱图。
26.图3是本发明的zh和hmme的荧光光谱图。
27.图4是利用热重分析(tga)测定的本发明的zh和hmme的有机成分图。
28.图5是利用esr检测超声波激发zh-peg(zp)和hmme产生单线态氧情况的图。
29.图6是本发明的zp-f3被黑色素瘤细胞b16/f10摄取的荧光显微镜照片。
30.图7是本发明的zp-f3在黑色素荷瘤小鼠中的体内荧光成像图。
31.图8是本发明的zp-f3在黑色素荷瘤小鼠重要器官和肿瘤中的荧光成像图。
32.图9是本发明的zp-f3在黑色素荷瘤小鼠模型中抑瘤效果图，图9中的(1)-(8)分别代表对小鼠进行的处理方式为：pbs、pbs+us、hmme、hmme+us、zp、zp+us、zp-f3、zp-f3+us。
33.图10是本发明的zp-f3在黑色素荷瘤小鼠模型中抑瘤数据，其中的(1)-(8)分别代表对小鼠进行的处理方式为：pbs、pbs+us、hmme、hmme+us、zp、zp+us、zp-f3、zp-f3+us。
34.图11是血卟啉单甲醚(hmme)的结构图。
35.具体实施方法：
36.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
37.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
38.下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
39.实施例1锆基有机框架材料的合成
40.将15mg氯化锆溶于5ml甲醇/dmf的混合溶液中(85:15v/v)，5mg血卟啉单甲醚(hmme，其结构式如图11所示)溶于10ml dmf/三甲胺的混合溶液中(50:1v/v)，分别记为溶液
①
和溶液
②
，随后将溶液
①
逐滴加入到溶液
②
，室温充分搅拌反应20分钟后，将其转移至水浴超声中(40khz)，冰浴超声6小时并于37℃搅拌过夜。12000rpm,10min离心收集沉淀后，分别用乙醇/dmf混合溶液(85:15v/v)、乙醇和去离子水洗3遍，最终获得锆基有机框架材料，即zr-hmme。
41.实施例2聚乙二醇修饰马来酰亚胺基团并连接靶向小分子多肽f3
42.将10mg的py-paa-peg水溶液(10ml)逐滴加入到10mg zr-hmme溶液(10ml)中，冰浴超声2小时，将peg包覆在材料表面，随后通过离心将包有peg的材料收集，并用去离子水洗三次，获得修饰有马来酰亚胺基团的zr-hmme，简称zp。随后将2mg小分子多肽f3溶解在水溶液中，并加入0.4mg tcep对多肽的巯基进行活化，二者的质量比为5：1，室温搅拌1小时后，逐滴加入zp水溶液(10mg)，继续室温搅拌1小时，完成f3的连接，最终离心得到负载有靶向小分子多肽f3的锆基有机框架材料，简称zp-f3，可通过部分干燥的方式对其进行定量，即取部分溶液于55℃烘箱烘干。产物用粒径仪检测其水合粒径大小图(1)，紫外可见分光光度计检测其吸光度(图2)，荧光光谱仪检测其荧光(图3)，tga检测其有机成分(图4)，电子自旋共振esr检测其在超声刺激下的单线态氧产生(图5)。
43.实施例3细胞层面肿瘤靶向荧光检测
44.通过激光共聚焦扫描显微镜(lcsm)检测zp-f3的特征性荧光吸收，探讨zp-f3的内吞作用。简单地说，将b16f10细胞以8
×
104细胞/皿的浓度接种，并将细胞在37℃的培养箱中孵育过夜。随后在b16f10细胞中加入一定浓度的zp或zp-f3(相当于hmme:10μg/ml)，孵育不同时间(0.5和4h)，孵育结束后，用4％多聚甲醛pbs固定细胞10min，pbs洗涤3次，dapi复染10min,clsm观察(图6)。
45.实施例4体内肿瘤靶向荧光检测
46.在雌性c57/b6(6-10周龄)中建立b16/f10细胞皮下注射后的黑色素荷瘤小鼠模型。利用每只小鼠皮下注射2百万b16/f10肿瘤细胞，在7-10天的时间可在小鼠的背部造模
成功。为评价不同药物在体内的荧光成像性能，对荷瘤c57/b6小鼠静脉注射游离hmme(100μl,0.4mg/ml)、zp和zp-f3(100μl,4mg/ml)纳米药物，然后麻醉小鼠2、4、8、12和24h，24h后安乐死，切除主要器官和肿瘤，观察荧光强度(图7和图8)发现，zp组和zp-f3在肿瘤中的积累要比单独的hmme组多，且增加了靶向的zp-f3组肿瘤荧光强度最高，进一步验证了其优良的靶向功能。
47.实施例5zp-f3的抑瘤效果
48.当肿瘤体积达到150mm3时，通过尾静脉注射2次，连续14d进行疗效检测。实验分为pbs组、pbs+超声组、hmme+超声组、zp+超声组和zp-f3+超声组，每组4个平行点。每次静脉注射后8h，超声处理2min，期间每2天记录小鼠体重和肿瘤大小，解剖后观测其肿瘤大小，分组顺序为pbs,pbs+us,hmme,hmme+us,zp,zp+us,zp-f3和zp-f3+us，超声条件为：1mhz,1w/cm2,50％duty cycle(图9-10)。
49.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。