一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用

本发明属于食品生物，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用。

背景技术：

1、抗菌脂肽(antimicrobial peptides，amps)具有抗菌谱广、作用迅速、不易产生耐药性等优点，在医药、化妆品、食品工业中具有广阔的应用前景。amps是由不同氨基酸组成的小分子蛋白质，具有分子量小、免疫原性低、机理特殊、易体内降解、不易产生耐药性等优点，这些优点赋予了抗菌脂肽在食品工业中的巨大应用潜力。芽孢杆菌产amps种类多、功能多、原料易获取、生产周期短、易于规模化发酵生产等突出优势；同时，amps结构稳定，在高温和酸性的环境也仍然保持活性；此外，amps还具有良好的广谱抑菌活性，可以抑制多种食源性致病菌，且对病毒、支原体等也具有显著的抑制效果。更为重要的是，与化学表面活性剂相比，amps具有低毒、易生物降解、良好的环境相容性等优点，在食品原料安全控制、食品加工环节、食品防腐保鲜、食品活性包装等方面可替代化学表面活性剂，具有很大的应用潜力。

2、amps具有的成本低、无毒害、周期短等明显优点，加快微生物抗菌脂肽的研究必将成为主流。当前对贝莱斯芽孢杆菌amps的研究主要集中在植物类抗真菌活性，比如贝莱斯芽孢杆菌d61-a对水稻根际土壤细菌群落结构的影响；贝莱斯芽孢杆菌对柑橘病原菌皮落青霉的生防探索等。另一方面，amps多采用酸沉淀等提取方法，但由于其疏水脂肪烃链的化学结构，经过沉淀烘干之后的amps很难复溶于水，大多采用甲醇或者乙腈等有毒性的有机溶剂复溶，这一缺点大大限制了amps提取物在食品方面的应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽。

2、本发明还要解决的技术问题是，提供上述抗菌脂肽的制备方法。

3、本发明最后要解决的技术问题是，提供上述抗菌脂肽在抑制食品受食源性致病菌侵染中的应用。

4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

5、一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽，其特征在于，所述的抗菌脂肽由贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bvq121 cctcc no：m 20211570经发酵、乳化构建o/w乳化体系和喷干制备得到。

6、其中，所述的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽的分子量在1-3kda，产量为1.527±0.03g/l。

7、上述贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)将贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis bvq121cctcc no：m 20211570菌种活化；

9、(2)将步骤(1)活化后的菌种接种到landy改进培养基中发酵培养获得发酵液后离心保留上清液；

10、(3)调节步骤(2)的上清液ph，低温过夜后，低温离心，弃上清液收集沉淀；

11、(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入乳化液，震荡混匀后获得o/w乳化体系；

12、(5)将步骤(4)获得的乳化体系进行喷干，制备得到抗菌脂肽粉末。

13、其中，步骤(2)中，所述的接种，其接种量为1-3％v/v。优选的，接种量为1.5％v/v。

14、其中，步骤(2)中，所述的发酵培养，其条件为：37℃摇床100-300r/min发酵24-48h。优选的条件为：37℃，摇床200r/min，发酵48h。

15、其中，步骤(2)中，所述的landy改进培养基，其配方为：葡萄糖20.0g/l，谷氨酸钠5.0g/l，酵母提取物1.0g/l，mgso4 0.5g/l，kcl 0.5g/l，kh2po4 1.0g/l，feso40.15mg/l，mnso4 0.5mg/l，cuso4 0.16mg/l。

16、其中，步骤(3)中，所述的ph，调节ph至2.0-4.0；所述的低温为4℃；所述的离心，其条件为6000-9000r/min，离心5-10min。优选的ph为4.0，离心条件为9000r/min、4℃离心10min。

17、其中，步骤(4)中，所述的乳化液，其加入量按照使得脂肽含量达到10-20mg/ml的浓度比添加。优选的加入量为：按照使得脂肽含量分别达到10mg/ml、20mg/ml的浓度比添加。

18、其中，步骤(4)中，所述的乳化液为甘油和水的混合溶液，其中水的体积为甘油的4-6倍。优选的，水的体积为甘油的4倍。

19、其中，步骤(5)中，所述的喷干，其工艺条件为：使用低温喷雾干燥机，连续80℃低温喷雾干燥，进料流量为40-60ml/min，进料温度20℃，出口温度60℃。

20、上述贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽在抑制食品受食源性致病菌侵染中的应用也在本发明所保护的范围之内。

21、其中，所述的食源性致病菌为鮰鱼爱德华氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的任意一种。优选的为沙门氏菌。

22、具体的，利用贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽制备得到的o/w乳化体系，乳液均一呈白色浑浊液体，证明贝莱斯芽孢杆菌脂肽充当乳化剂取得了良好成效，可作为食品乳化剂。

23、具体的，贝莱斯芽孢杆菌bvq121发酵液对致病菌(鮰鱼爱德华氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌)增殖具有明显的抑菌效果，对比抑菌圈直径的大小发现，发酵液抑菌效果与剂量呈正相关，相同剂量下的发酵液对沙门氏菌的抑制效果最为显著，抑菌圈直径最高在添加100μl发酵液时达到了26.50mm，对大肠杆菌和鮰鱼爱德华氏菌的抑菌圈分别为24.5mm和18.0mm

24、具体的，继续采用沙门氏菌作为指示菌进行评价实验，对比抑菌圈平均值直径的大小可以发现，添加了脂肽的甘油乳液抑菌效果明显，20mg/ml的贝莱斯芽孢杆菌脂肽乳液抑菌效果较10mg/ml的贝莱斯芽孢杆菌脂肽乳液抑菌效果较优。其中添加100μlo/w乳化体系(脂肽/油相＝20mg/ml)的抑菌圈直径最高，达到了(17.85±2.33)mm，以往用甲醇复溶的脂肽，抑菌圈通常为14.20±1.65mm，相较于甲醇复溶，甘油乳化后的脂肽复溶物抑菌效果提升了25％左右。这些数据证明贝莱斯芽孢杆菌表面活性素作为乳化剂应用于乳化体系中提升其抑菌效果。

25、具体的，利用高效液相色谱，根据从bvq121提取的粗脂肽样品在hplc上的出峰保留时间和标准品的对比来看，该菌株抗菌肽的保留时间在7-20分钟之间。抗菌脂肽样品在7-10分钟，12-16分钟和16-20分钟的保留时间与标准品一致，可以证实该抗菌脂肽主要由surfactin的同系物构成，证实了bvq121发酵产物成分，该surfactin的同系物已被验证了对几类食源性致病菌有抑菌效果。

26、具体的，通过maldi-tof-ms质谱分析，结合查阅文献并对照图表，发现本发明得到的抗菌肽的主要成分为c13-c16 iturin、c12-c15 surfactin和c15-c23 fengycin以及三种抗菌肽的部分同系物，每种成分在食品加工环节种都有相应的应用。

27、一株产抗菌脂肽的贝莱斯芽孢杆菌，其中，所述的贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，菌株号为bvq121，已于2021年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211570。

28、有益效果：

29、(1)bvq121菌株表现出对于常见的食源性致病菌有良好的抑制效果，在抑菌谱上有所拓展，具有一定的研究价值。

30、(2)本发明在提取抗菌脂肽时，改进了制备方法，采用乳化体系与喷干技术相结合的手段，提高了amps水溶性的同时解决了有机溶剂的毒性问题，并且增加了amps复溶物的抑菌活性。