一种卤虫病毒及其检测方法和应用与流程

本发明属于海洋病原微生物检测，具体涉及一种未分类卤虫病毒及其检测方法和应用。

背景技术：

1、杆状病毒科（ virgaviridae）是一类单股正链rna病毒，国际病毒分类委员会将杆状病毒科分为7个属， furovirus， goravirus， hordeivirus， pecluvirus， pomovirus， tobamovirus及 tobravirus。发明人首次在全球多地卤虫卵中发现一种分布广泛的未分类病毒，该病毒分类上属于一个全新的病毒，对该病毒暂时命名为卤虫类杆状病毒（brineshrimp virga-like virus 1）。由于卤虫是养殖甲壳动物和鱼类的重要饵料，对此病毒的有效检测是进行该病毒乃至该属其它病毒的追踪、调研、预防和控制的前提，因此，需要提供一种有效的检测病毒的方法。

技术实现思路

1、针对目前尚没有针对卤虫类杆状病毒检测方法的问题，本发明提供一种检测卤虫类杆状病毒的方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

3、一种卤虫类杆状病毒（brine shrimp virga-like virus 1, bsvv1），属于杆状病毒科（ virgaviridae），保藏编号为cctcc no: v202273。所述卤虫类杆状病毒呈杆状，为单股正链rna病毒，病毒粒子直径约20 nm，长度约300nm。能够感染卤虫卵及其制备的原代细胞。

4、作为新病毒，国际病毒分类委员会（ictv）可能会给出其他的命名规则，因此卤虫类杆状病毒（bsvv1）作为该病毒的一个泛称，指代本发明所保护的同名病毒以及所有其他名称所代表的符合基因或多肽序列同源性的病毒。已测定的卤虫类杆状病毒的基因组序列如seq id no: 1、seq id no: 56- seq id no: 65所示。由于bsvv1是rna病毒，其用于复制自身基因组rna的依赖于rna的rna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，因此该酶在复制过程中没有纠错能力，其基因组的全部或部分存在较大的变异性。该病毒的分类是以依赖于rna的rna聚合酶为依据，在不影响该病毒种属分类的前提下，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在同源性≥74.5%的变异。

5、一种检测卤虫类杆状病毒的试剂盒，其检测的核苷酸为：

6、（a）：seq id no: 1、seq id no: 56- seq id no: 65任一所示的rna；或

7、（b）：（a）转换的dna；或

8、（c）：（a）和（b）的≥74.5%同源的rna或dna；或

9、（d）：与（a）或（b）或（c）或（d）或（e）反向互补的rna和dna；或

10、（e）：（a）-（d）任一所示的部分；所述部分的长度为30 nt-3000 nt。

11、优选的，所述部分的长度为70 nt-1200 nt。

12、更为优选的，所述部分的序列为：

13、（e1）seq id no: 2-3、4-5、6-7、8-9、10-11、12-13、14-15、16-17、18-19、20-21、22-23、24-25、26-27、28-29、30-31、32-33、34-35、36-37、38-39、40-41、42-43、44-45、46-47、48-49、50-51所示的成对引物扩增的序列，或

14、（e2）成对引物扩增的序列互补序列。

15、上述试剂盒是以卤虫类杆状病毒的核酸序列为检测目标，采用核酸扩增方法、核酸探针方法进行检测。

16、进一步的，上述试剂盒还包括1对或1对以上的成对引物。

17、所述成对引物选自确定碱基的核酸、含简并碱基的核酸或含修饰碱基的核酸，如，包含锁核酸的核酸。为了对≥74.5%同源的核酸序列进行检测，最简单的方式是将存在单核苷酸多样性的突变位点视为相应的碱基的简并位点，从而可用包含多种突变碱基的简并碱基的序列作为引物序列；对于这种简并方式也可用次黄嘌呤或其他等效碱基代替。

18、所述引物的长度为9 nt-45 nt；优选的，长度为15 nt-30 nt；更优选的，长度为18nt-25 nt。

19、进一步的，所述引物选自如seq id no: 2- seq id no: 51所示的任意成对的核酸序列或其反向互补的核酸序列。所述引物选自seq id no: 2- seq id no: 51中任意2条序列之间的核酸序列片段或其反向互补的核酸序列片段。

20、当包含1对引物时，可采用常规pcr检测、sybr green i染色的实时荧光定量pcr检测、数字pcr检测或依赖于解旋酶的等温扩增（hda）检测。

21、当包含1对以上引物时，可采用套式pcr或多重pcr检测，套式pcr采用2对嵌套的引物，其中外侧的1对引物作为套式pcr的外引物用于第一步扩增，内侧的1对引物作为套式pcr的内引物用于第二步扩增；多重pcr采用2对或更多对相互独立的引物，对多个位点或不同基因型的卤虫类杆状病毒或其变异体进行检测。

22、在引物设计中，还可以在引物的5’端包含1 nt-100 nt的非特异性序列，这些非特异性序列可以用于改变引物性能，如改变tm值或gc含量；也可以是为了将特异性序列固定在载体如基因芯片上的锚定序列；还可以是为了纯化蛋白等的功能性序列，如his标签序列、s-tag多肽编码序列、thrombin蛋白酶酶切位点编码序列。

23、上述试剂盒还可包括核酸探针。

24、所述核酸探针选自序列如seq id no: 2- seq id no: 52所示的核酸或互补的核酸。核酸探针可以用地高辛（dig）、荧光素或者放射性同位素等进行所有核苷酸或特定核苷酸，如dig-dutp，的掺入法标记；也可以用dig、荧光素、报告基团、荧光淬灭基团或放射性同位素等进行末端修饰标记，例如探针的5’端标记fam、hex、vic等，3’端标记淬灭基团tamra等；进行直接对卤虫类杆状病毒或其他变异的同源病毒的基因组核酸进行独立的原位杂交或斑点杂交检测，也可与实时定量pcr技术联合，进行taqman探针或beacon探针的荧光定量pcr检测。

25、所述的试剂盒的检测方法包括但不限于常规聚合酶链式反应（pcr）、恒温对流pcr、套式pcr、实时荧光pcr、恒温对流实时荧光pcr、数字pcr、斑点杂交、原位杂交、环介导等温扩增（lamp）、滚环扩增技术（rca）、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增技术（hda）、交叉引物扩增技术、核酸快递等温检测放大技术；也可包括但不限于同时对1株或1种以上卤虫类杆状病毒与其同源种或变异种的多重pcr、多重实时荧光pcr、基因芯片、芯片检测；还可以包括但不限于同时对包含卤虫类杆状病毒及其同源种或变异种的多重pcr、多重实时荧光pcr、基因芯片、芯片检测。

26、一种检测卤虫类杆状病毒的试剂盒，其检测的多肽为：

27、（a）：seq id no: 1、seq id no: 56- seq id no: 65任一的核酸序列翻译的多肽序列及多肽片段；或

28、（b）：与seq id no: 1、seq id no: 56-seq id no: 65任一的核酸序列翻译的多肽序列有≥74.5%同源的多肽序列及多肽片段；或

29、（c）：（a）或（b）的抗原或抗体。

30、如seq id no: 1所示基因组序列翻译的氨基酸序列包括：开放阅读框1（orf1）的起始位点为497，终止位点为12469，共3990个氨基酸；orf2的起始位点为12554，终止位点为17581，共1675个氨基酸；orf3的起始位点为17659，终止位点为18186，共175个氨基酸；氨基酸序列分别如seq id no: 53-55所示。seq id no: 56-65所示基因组的orf1-orf3序列翻译的氨基酸序列分别如seqid no: 66-95所示。

31、优选的，所述检测的多肽为：

32、（a1）：seq id no: 53-55、seq id no: 66-95任一所示的多肽；或

33、（b1）：与seq id no: 53-55、seq id no: 66-95任一所示有≥77.0%同源的多肽；或

34、（c1）：（a1）或（b1）的抗原或抗体。

35、所述抗原可以是病毒株整体、裂解成分、衣壳、多肽、基因工程蛋白或多肽。所述抗体可以为多克隆抗体、杂交瘤细胞、单克隆抗体或单链抗体。所述核酸适配体可以为使用一个或多个多肽特异性序列经selex技术筛选所得的一条或多条核酸序列的单链rna、单链dna或单链锁核酸序列，可以通过核酸扩增、核酸克隆或人工合成制备特异性核酸适配体。所述抗原、抗体或核酸适配体可以按照现有技术的方法进行制备。

36、所述试剂盒的检测方法，可采用竞争性、间接或夹心型免疫反应也可采用固体支持物或免疫沉淀法。所述卤虫类杆状病毒的抗体或抗原性片段可采用现有技术进行标记，如荧光标记、化学发光标记、放射性标记或酶标记。扩增探针信号可以采用生物素和亲和素的方法，酶标记和介导的免疫试验，如elisa检验。

37、本发明的保护范围也包括上述卤虫类杆状病毒的抗血清、多克隆抗体、杂交瘤细胞、单克隆抗体、单链抗体或表达单链抗体的菌株或细胞株、核酸适配体或克隆表达生产核酸适配体的菌株。所述抗血清、多克隆抗体、杂交瘤细胞、单克隆抗体、单链抗体或核酸适配体以含有多肽特异性序列的卤虫类杆状病毒的病毒株，病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程蛋白或多肽为免疫原按照现有技术的方法进行制备。

38、如，所述抗卤虫类杆状病毒的抗体为单克隆抗体，可将浓缩的含多肽特异性序列的卤虫类杆状病毒株或其特定抗原片段，如，orf1、orf2、orf3的抗原蛋白施予动物，如，小鼠，视需要可添加适当的佐剂，如：弗氏完全佐剂以进行初次免疫。经适当时间间隔后，视需要以灭活的病毒(或抗原蛋白)及适当的佐剂施与二次免疫。经适当时间间隔后，采集免疫动物的血清，用以评估适合用以采集脾脏细胞的小鼠。从所述适用的小鼠采集脾脏细胞与骨髓瘤细胞，如：fo细胞株、ns细胞株以peg进行细胞融合。从融合细胞中筛选出具分泌能力的杂交瘤细胞株后，得到融合细胞系，该融合细胞系可分泌抗卤虫类杆状病毒的单克隆抗体。

39、本发明具有以下优点：

40、本发明的卤虫类杆状病毒是一种新的卤虫病毒，可感染卤虫。本发明提供了基于卤虫类杆状病毒基因组序列的所建立的核酸扩增、抗原结合等特异性检测方法及基于上述方法所产生的试剂盒、检测设备和检测分析及其应用，为养殖甲壳动物和鱼类鲜活饵料的检测与防控提供新的可能。

41、生物保藏信息

42、卤虫类杆状病毒（brine shrimp virga-like virus 1），于2022年09月07日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏地址为中国武汉，武汉大学保藏中心，保藏编号为cctcc no: v202273。