重组结核分枝杆菌抗原、其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种重组结核分枝杆菌抗原、其制备方法和应用。

背景技术：

1、结核病(tuberculosis，tb)是威胁人类健康的一种重要传染病。根据世界卫生组织2020年发布的全球结核病报告，2019年估计有1000万人(范围：890-1100万)罹患结核病，近年来这一数字以非常缓慢的速度下降。结核病的病原体是结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)，其主要通过呼吸道传播，还可通过消化道进入人体。结核分枝杆菌感染可造成多种系统或脏器的结核病变，如肺结核、骨结核、肾结核、结核性脑膜炎等。

2、迄今为止，卡介苗(bcg)是全球唯一被批准使用的预防结核病的疫苗，然而其效果备受争议。通常认为，卡介苗对于预防重症结核，如小儿粟粒性结核病、结核病脑膜炎比较有效，但不能预防原发性感染，对于预防结核病传播的效果有限。已研发的其他疫苗，例如营养缺陷型结核减毒活疫苗、bcg重组疫苗、结核亚单位疫苗以及dna疫苗等的保护效果也不理想，目前尚没有新的疫苗可以完全取代bcg。

3、因此，研发更有效、更安全、适用于各类人群使用的防治结核病的疫苗是非常必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种对结核分枝杆菌感染具有显著的保护作用的重组结核分枝杆菌抗原。

2、在一方面，本发明提供一种重组结核分枝杆菌抗原，包含选自esx家族、pe/ppe家族和dosr家族中的至少一个蛋白或其功能活性片段，优选为至少两个蛋白或其功能活性片段。

3、在一些实施方式中，esx家族的蛋白选自esat-6(esxa,rv3875)、cfp-10(esxb,rv3874)、esxb(rv3890c)、esxc(rv3891c)、esxd(rv3891c)、esxe(rv3904c)、esxf(rv3905)、tb9.8(esxg,rv0287)、tb10.4(esxh,rv0288)、mtb9.9d(esxi,rv1037c)、esxj(rv1038c)、esxk(rv1197)、mtb9.9c(esxl,rv1198)、esxm(rv1792)、mtb9.9a(esxn,rv1793)、mtb9.9c(esxo,rv2346c)、tb11.0(esxp,rv2347c)、tb12.9(esxq,rv3017c)、tb10.3(esxr,rv3019c)、esxs(rv3020c)、esxt(rv3444c)、esxu(rv3445c)、esxv(rv3619c)、esxw(rv3620c)中的一种或多种。

4、在优选的实施方式中，esx家族的蛋白选自cfp-10(esxb,rv3874)、tb10.4(esxh,rv0288)、tb10.3(esxr,rv3019c)中的一种或多种。

5、在一些实施方式中，pe/ppe家族的蛋白选自pe4、pe5、pe15、ppe2、ppe10、ppe13、ppe17、ppe18、ppe25、ppe34、ppe35、ppe37、ppe38、ppe42、ppe57、pe-pgrs11、pe-pgrs17、pe-pgrs26、pe-pgrs30、pe-pgrs33、pe-pgrs62、pe35-ppe68、pe25-ppe41中的一种或多种。

6、在优选的实施方式中，pe/ppe家族的蛋白选自pe25(rv2431c)、pe35(rv3872)、ppe41(rv2430c)、ppe57(rv3425)、ppe68(rv3873)、pe-pgrs17(rv0978c)中的一种或多种。优选地，pe25和ppe41形成pe25-ppe41复合物、pe35和ppe68形成pe35-ppe68复合物。

7、在一些实施方式中，dosr家族的蛋白选自pfkb(rv2029c)、hspx(rv2031c,acr)、rv2626c、rv2627c、rv3133c中的一种或多种。

8、在一些实施方式中，所述至少两个蛋白或其功能活性片段全部或一部分相互融合形成融合蛋白或直接混合形成组合物，例如所有的蛋白或其功能活性片段直接混合形成组合物，或者相互融合形成融合蛋白，或者其中部分蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白与其余蛋白或其功能活性片段形成组合物，或者其中部分蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白与其余蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白形成组合物。

9、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原源自结核分枝杆菌esx家族、pe/ppe家族和dosr家族中的至少两个家族，优选地，所述抗原包含至少一个esx家族蛋白、至少一个pe/ppe家族蛋白和至少一个dosr家族蛋白。

10、在一些实施方式中，所述抗原包含pe35、ppe68、cfp-10、rv2627c、rv2626c和rv2031c中的至少两个蛋白或其功能活性片段。

11、在一些实施方式中，pe35包含seq id no:1所示的氨基酸序列，ppe68包含seq idno:2所示的氨基酸序列，cfp-10包含seq id no:3所示的氨基酸序列，rv2627c包含seq idno:4所示的氨基酸序列，rv2626c包含seq id no:22所示的氨基酸序列，rv2031c包含seqid no:23所示的氨基酸序列，tb10.4包含seq id no:40所示的氨基酸序列，tb10.3包含seqid no:41所示的氨基酸序列，pe25包含seq id no:42所示的氨基酸序列，ppe41包含seq idno:43所示的氨基酸序列，pe-pgrs17包含seq id no:44所示的氨基酸序列，ppe57包含seqid no:45所示的氨基酸序列，pfkb包含seq id no:46所示的氨基酸序列。

12、在一些实施方式中，所述抗原进一步包含esx家族、pe/ppe家族和dosr家族以外的蛋白，例如，选自ag85a、ag85b、ag85c、lpqh(rv3763)、hspr(rv0353,hspr)、hsp65、hsp70(rv0350,dnak)中的一种或多种蛋白或其功能活性片段，优选hsp65、hsp70(rv0350,dnak)或其功能活性片段，hsp65包含seq id no:47所示的氨基酸序列，hsp70包含seq id no:48所示的氨基酸序列。在包含这些蛋白的情况下，可以从esx家族、pe/ppe家族和dosr家族中选择一个或多个蛋白与这些蛋白形成融合蛋白或组合物。

13、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35、ppe68、cfp-10、rv2627c、rv2626c和rv2031c中的任意两个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白，两个蛋白可以以任意顺序连接，以pe35和ppe68形成的融合蛋白为例，融合蛋白可以为pe35-ppe68，也可以为ppe68-pe35。

14、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35、ppe68、cfp-10、rv2627c、rv2626c和rv2031c中的任意三个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白，三个蛋白可以以任意顺序连接，以pe35、ppe68和cfp-10形成的融合蛋白为例，融合蛋白可以为pe35-ppe68-cfp-10、pe35-cfp-10-ppe68、ppe68-pe35-cfp-10、ppe68-cfp-10-pe35、cfp-10-pe35-ppe68或者cfp-10-ppe68-pe35。

15、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35、ppe68、cfp-10、rv2627c、rv2626c和rv2031c中的四个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白，四个蛋白可以以任意顺序连接，例如，融合蛋白可以为pe35-ppe68-cfp-10-rv2627c、pe35-cfp-10-ppe68-rv2627c、ppe68-pe35-cfp-10-rv2627c、ppe68-cfp-10-pe35-rv2627c、cfp-10-pe35-ppe68-rv2627c、cfp-10-ppe68-pe35-rv2627c、rv2627c-cfp-10-pe35-ppe68、rv2627c-ppe68-pe35-cfp-10、pe35-ppe68-cfp-10-rv2626c、pe35-cfp-10-ppe68-rv2626c、ppe68-pe35-cfp-10-rv2626c、ppe68-cfp-10-pe35-rv2626c、cfp-10-pe35-ppe68-rv2626c、cfp-10-ppe68-pe35-rv2626c、rv2626c-cfp-10-pe35-ppe68、rv2626c-ppe68-pe35-cfp-10、pe35-ppe68-cfp-10-rv2031c、pe35-cfp-10-ppe68-rv2031c、ppe68-pe35-cfp-10-rv2031c、ppe68-cfp-10-pe35-rv2031c、cfp-10-pe35-ppe68-rv2031c、cfp-10-ppe68-pe35-rv2031c、rv2031c-cfp-10-pe35-ppe68或rv2031c-ppe68-pe35-cfp-10等。

16、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35、ppe68、cfp-10、rv2627c、rv2626c和rv2031c中的五个或六个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白，各个蛋白可以以任意顺序连接。

17、在一些实施方式中，各个蛋白直接相连或通过连接子相连，例如，连接子可以为一个或多个ggs。

18、在优选的实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含rv2626c和rv2031c中的至少一个蛋白或其功能活性片段。

19、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含rv2031c、rv2626c或其功能活性片段与pe35、ppe68和cfp-10中的至少一个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白。

20、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含cfp-10或其功能活性片段与rv2626c或其功能活性片段形成的融合蛋白，或者包含cfp-10或其功能活性片段与rv2031c或其功能活性片段形成的融合蛋白。

21、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35、ppe68、cfp-10和rv2626c四个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白。

22、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35、ppe68、cfp-10和rv2031c四个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白。

23、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含两种或更多种融合蛋白形成的组合物。

24、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35-ppe68融合蛋白、cfp-10-rv2627c融合蛋白、cfp-10-rv2626c融合蛋白和cfp-10-rv2031c融合蛋白中的两种或更多种。

25、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含pe35-ppe68融合蛋白和cfp-10-rv2627c融合蛋白，或者包含pe35-ppe68融合蛋白和cfp-10-rv2626c融合蛋白，或者包含pe35-ppe68融合蛋白和cfp-10-rv2031c融合蛋白。

26、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原还包含增强免疫原性的多肽。

27、在一些实施方式中，所述增强免疫原性的多肽的序列包含seq id no:5和48-53所示的氨基酸序列。

28、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原包含seq id no:6-8、24-27和55中任一项所示的氨基酸序列或其任意组合。

29、在一些实施方式中，所述重组结核分枝杆菌抗原进一步包含seq id no:9所示的氨基酸序列。

30、在另一方面，本发明还提供一种编码所述重组结核分枝杆菌抗原的核苷酸序列。

31、在一些实施方式中，所述核苷酸序列包含seq id no:10-12、28-31和56中任一项所示的核苷酸序列。

32、在一些实施方式中，所述核苷酸序列进一步包含seq id no:13所示的核苷酸序列。

33、在另一方面，本发明还提供一种包含上述核苷酸序列的重组载体。

34、在另一方面，本发明还提供一种包含上述重组载体的表达系统细胞。

35、在一些实施方式中，所述表达系统的细胞包括为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括293t细胞或cho细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。

36、在另一方面，本发明还提供一种制备所述重组结核分枝杆菌抗原的方法，包括以下步骤：

37、利用编码所述重组结核分枝杆菌抗原的核苷酸序列构建重组表达质粒；

38、将构建的重组表达质粒转化宿主菌，筛选正确的重组表达质粒，

39、利用筛选的重组表达质粒转染表达系统的细胞，表达后收集上清并纯化得到重组结核分枝杆菌抗原。

40、在另一方面，本发明还提供一种所述重组结核分枝杆菌抗原、编码所述重组结核分枝杆菌抗原的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的重组载体、包含所述重组载体的表达系统细胞在制备结核病疫苗中的应用。

41、在另一方面，本发明还提供一种结核病疫苗，包含所述重组结核分枝杆菌抗原和佐剂。

42、在一些实施方式中，所述佐剂选自铝佐剂、mf59佐剂、mpl佐剂、qs-21、gla、cpg、as01、as02、as03、as04佐剂中的一种或多种。

43、在一些实施方式中，所述结核病疫苗进一步包含卡介苗(bcg)。

44、本发明还提供了一种结核病dna疫苗，其包含编码所述重组结核分枝杆菌抗原的dna序列。

45、在一些实施方式中，所述dna序列包含seq id no:14-16、32-35和57中任一项所示的序列。

46、在一些实施方式中，所述dna序列包含seq id no:17所示的序列。

47、本发明还提供了一种结核病mrna疫苗，其包含编码所述重组结核分枝杆菌抗原的mrna序列。

48、在一些实施方式中，所述mrna序列包含seq id no:18-20、36-39和58中任一项所示的序列。

49、在一些实施方式中，所述mrna序列进一步包含seq id no:21所示的序列。

50、本发明还提供了一种用于预防或治疗结核病的病毒载体疫苗，其含有重组病毒载体，所述重组病毒载体包含编码所述重组结核分枝杆菌抗原的核苷酸序列。

51、在一些实施方式中，所述病毒载体选自以下的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。

52、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

53、本发明提供了pe35、ppe68、cfp-10、rv2627c、rv2626c和rv2031c中的至少两个蛋白或其功能活性片段形成的融合蛋白，实验结果表明，p2p3(pe35-ppe68)、c4r7(cfp-10-rv2627c)、c4dr24(cfp-10-rv2626c)、c4dr36(cfp-10-rv2031c)、p2p3-c4r7、p2p3-c4dr24和p2p3-c4dr36等融合抗原或其组合可以诱导小鼠产生明显的免疫反应，对结核分枝杆菌感染具有显著的保护作用。