一株高效利用水解液的抗逆高产酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用

本发明属于生物，具体涉及一株高效利用水解液的抗逆高产酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用。

背景技术：

1、我国是农业大国，农业秸秆年产生量超过9亿吨，资源化能源化利用潜力十分巨大。因而，利用这些废弃生物质资源生产可再生能源，是我国解决资源和能源瓶颈制约、转变经济增长模式、保障循环经济可持续发展的重要能源战略。事实上，纤维素乙醇是以农业废弃物、木材等生物质中的纤维素为主要原料，通过生物发酵转化的燃料乙醇产品，其生产工艺一般包括原料预处理、纤维素酶水解、酵母发酵等单元。纤维素乙醇作为一种绿色可再生替代能源，具有显著的能量收益和碳减排效益，也是实现废弃生物质资源化能源化利用的重要战略，对保障我国可持续发展、能源安全以及环境友好意义重大。

2、尽管我国秸秆等木质纤维素生物质资源储备丰富，但纤维素乙醇起步较晚，与国外生产技术及产业化水平差距较大，纤维素乙醇生产工艺成本居高不下，在原料预处理、纤维素酶水解、发酵等工艺环节存在着一些技术难题亟待解决，其中尤以酵母菌株乙醇发酵性能不足、多元胁迫耐性不足、水解碳源利用能力不足等问题较为突出，这些因素严重制约了我国纤维素乙醇产业化发展。

3、事实上，酿酒酵母能够以纤维素生物质水解糖为发酵碳源，通过无氧发酵合成乙醇。纤维素生物质主要有纤维素、半纤维素和木质素组成，通常使用稀硫酸对纤维素生物质进行预处理，打破致密结构以释放更多水解糖，然而经过稀酸处理将导致多种发酵抑制剂形成，主要包括甲酸、乙酸，糠醛，5-羟甲基糠醛等，它们对酿酒酵母细胞具有强毒性，如破坏细胞内ph稳态，影响细胞壁和质膜的功能，诱导氧化应激和程序性细胞死亡，抑制酵母细胞的乙醇脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、乙醛脱氢酶活力，导致线粒体、液泡膜、细胞骨架、细胞核染色质受损，进而降低酿酒酵母生长代谢及产醇活力。此外，纤维素乙醇生物炼制过程中，纤维素酶所需的高温环境，会进一步加剧抑制物对酿酒酵母的毒害作用，造成乙醇产量、生产强度及糖醇转化率大幅降低。因而兼顾提升酿酒酵母高温及毒性水解液发酵性能，意义重大。

4、近年来，针对酿酒酵母水解液抑制物以及高温胁迫耐性研究，已有相关报道。张黎杰(酿酒酵母jjj1基因敲除提高乙酸耐性和纤维乙醇发性能[d].浙江大学,2016.)对酿酒酵母菌株by4741敲除了jjj1基因，其敲除菌对甲酸和乙酸的胁迫耐性显著增强。在5.5g/l乙酸、1.2g/l甲酸或复合抑制物存在的毒性水解液培养基中，发酵生产周期缩短了17h，乙醇生产强度提高至0.75g/l/h。张克俞等(关键基因过表达提高酿酒酵母抑制剂耐受性及乙醇发酵性能[j].应用与环境生物学报,2018,24(03):541-546.)对酿酒酵母by4741过表达ade17基因，有效提升了酿酒酵母对乙酸、糠醛的耐受性能，利用100g/l葡萄糖发酵乙醇产量为35.85g/l，糖醇转化率为0.36g/g。专利cn113980993a公开了mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用，通过敲除mal33基因，对乙酸等水解液抑制物耐受性大幅度提高，在含有3.5g/l乙酸的混合糖培养基中，菌株代谢迟滞期缩短了24h，发酵生产周期缩短了20h。目前，大多数研究报道停留在基因工程策略，在高温下利用毒性水解液进行厌氧乙醇发酵的研究工作鲜有报道。

技术实现思路

1、为有效解决高温毒性水解液乙醇发酵过程中，高温及抑制物等胁迫因素对酿酒酵母细胞的强胁迫或毒性作用，导致酿酒酵母厌氧乙醇发酵性能不稳定、不理想的问题，本发明提供了一株高效利用水解液的抗逆高产酵母及其选育方法与高浓度乙醇发酵应用。

2、本发明一方面提供了一株高效利用水解液的抗逆高产酵母，是由酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg(菌种保藏编号：cctcc m 20221770)经高温毒性水解液驯化选育及高通量筛选获得，于2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，命名为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)sg100，保藏编号为：cctcc m 20221771。

3、进一步地，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100能够在36-40℃、100-300g/l毒性水解液条件下具有良好厌氧乙醇发酵性能，糖醇转化率最高可达0.49g/g，40℃发酵消耗葡萄糖高达240g/l，乙醇浓度达96g/l，菌体浓度较传统酵母菌株eb、4126、6525提高70％-100％，发酵过程乙醇生产强度可达3.3-4.0g/l/h。

4、本发明第二方面提供了酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100选育方法，包括高温毒性水解液驯化选育与高通量筛选。

5、进一步地，高温毒性水解液驯化选育方法包括以下步骤：

6、(1)将权利要求1中的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg稀释涂布于ypd固体培养基上，在36℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母sg单菌落；

7、(2)将上述步骤(1)中的酿酒酵母sg单菌落，转接至ypd液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母sg活化菌液；

8、(3)将上述步骤(2)中的酿酒酵母sg活化菌液，按5-10％接种量转接至毒性水解液培养基中，于36℃，150rpm连续转接、培养25个周期，每个周期维持24h，获得酿酒酵母菌液；

9、(4)将上述步骤(3)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于含有ypd固体培养基上，在38℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；

10、(5)将上述步骤(4)中的酿酒酵母单菌落，转接至含有ypd液体培养基中，于38℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母活化菌液；

11、(6)将上述步骤(5)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至毒性水解液培养基中，于38℃，150rpm连续转接、培养25个周期，每个周期维持24h，获得酿酒酵母菌液；

12、(7)将上述步骤(6)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于ypd固体培养基上，在40℃条件下培养12-24h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；

13、(8)将上述步骤(7)中的酿酒酵母单菌落，转接至ypd液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养12-24h，获得酿酒酵母活化菌液；

14、(9)将上述步骤(8)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至毒性水解液培养基中，于40℃，150rpm连续转接、培养25个周期，每个周期维持24h，获得酿酒酵母菌液；

15、(10)将上述步骤(9)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于ypd固体培养基上，在42℃条件下培养24-36h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落；

16、(11)将上述步骤(10)中的酿酒酵母单菌落，转接至ypd液体培养基中，于42℃、150rpm活化培养24-36h，获得酿酒酵母活化菌液；

17、(12)将上述步骤(11)中的酿酒酵母活化菌液，按5-10％接种量转接至毒性水解液培养基中，于42℃，150rpm连续转接、培养25个周期，每个周期维持24h，获得酿酒酵母活化菌液；

18、(13)将上述步骤(12)中的酿酒酵母菌液稀释涂布于ypd固体培养基上，在44℃条件下培养48-60h，优先挑取最先长出的酿酒酵母单菌落，即为适于高温毒性水解液的抗逆酿酒酵母；

19、(14)将上述步骤(13)中获得的单菌落，分别转接至ypd液体培养基中，于36℃、150rpm活化培养12-24h，再与40％甘油溶液混合，各冻存于-80℃环境，即高温毒性水解液驯化选育获得的酿酒酵母菌液。

20、更进一步地，高通量筛选方法包括以下步骤：

21、(1)将上述高温毒性水解液驯化选育获得的酿酒酵母菌液，按1％接种量分别转接至ypd液体培养基中，于40℃、150rpm活化培养12-24h后，再按5-10％接种量转接至发酵培养基中，于40℃、150rpm发酵培养24-36h；

22、(2)将上述步骤(1)中的发酵菌液进行梯度稀释(10-5，10-6,10-7)，用移液器吸取100μl稀释液，均匀涂布于含有毒性水解液的固体培养基上，于40℃培养至48-72h形成单菌落；

23、(3)使用一次性96孔板，单孔加入200μl毒性水解液培养基；

24、(4)挑取上述步骤(2)中的全部单菌落，分别转接至到上述步骤(3)中的96孔板中进行发酵培养，使用高通量q-mix系统，测量初始od600，在40℃静置培养24h后再次测量od600，初筛获得培养24hod600与初始od600差值＞3.5的酿酒酵母菌株；

25、(5)将上述步骤(4)中初筛的酿酒酵母菌株，经过活化后，再按10％接种量转接至装有200μl毒性水解液培养基的96孔板孔洞中，于40℃静置培养至发酵终点即无气泡产生且菌体沉降至孔板底部，复筛获得发酵完全后残糖含量最低、乙醇浓度最高的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100。

26、上述酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100高浓度乙醇发酵应用中，在36-40℃高温下进行的厌氧乙醇发酵。

27、本发明第三方面提供了酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100高浓度乙醇发酵应用方法，包括以下步骤：

28、(1)无菌条件下，将酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100保藏液稀释涂布于ypd固体培养基，36-40℃恒温静置培养12-48h后，获得单菌落，用于液体活化培养；

29、(2)在无菌条件下，将上述步骤(1)中单菌落接种到ypd液体培养基中，36-40℃，150-200rpm振荡培养12-48h，制备活化菌液，用于厌氧乙醇发酵培养；

30、(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中活化菌液按5％-10％接种量接入毒性水解液培养基中，36-40℃，150-200rpm，密闭厌氧乙醇发酵培养24-72h。

31、进一步地，所用的毒性水解液培养基营养成分包含葡萄糖100-300g/l，酵母提取物12-36g/l，蛋白胨6-18g/l，硫酸铵1.5-4.5g/l，磷酸二氢钾1.5-4.5g/l，尿素1-3g/l，谷氨酸钠0.5-1.5g/l，七水合硫酸镁0.5-1.0g/l，一水合硫酸锰0.001-0.01g/l，七水合硫酸锌0.05-0.5g/l，五水合硫酸铜0.001-0.01g/l，氯化钙0.01-0.1g/l，六水合氯化铁0.01-0.1g/l，碘化钾0.001-0.01g/l，肌醇0.05-0.15g/l，维生素b5 0.05-0.15g/l，生物素0.1-0.5g/l，烟酸0.01-0.1g/l，对氨基苯甲酸0.01-0.1g/l，hcl-硫胺素0.01-0.05g/l，hcl-吡哆醛0.01-0.1g/l，其余为水，自然ph。

32、本发明的有益效果：本发明基于前期在厌氧、高温、抑制物胁迫环境中分离获得的(saccharomyces cerevisiae)sg(菌种保藏编号：cctcc m 20221770)，通过高温毒性水解液驯化选育及高通量筛选方法，获得了一株高效利用水解液的抗逆高产酵母菌株，命名为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)sg100，于2022年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc m 20221771。其在36-40℃、含有100-300g/l葡萄糖的毒性水解液条件下具有良好厌氧发酵性能，糖醇转化率高达0.49g/g，40℃发酵可消耗240g/l葡萄糖，乙醇浓度达96g/l，菌体浓度较传统酵母菌株提高70％-100％，发酵过程乙醇生产强度可达3.3-4.0g/l/h。综上所述，本发明丰富了乙醇生产优良菌种资源与种类，有效解决了高温毒性水解液乙醇发酵过程中，高温及抑制物等胁迫因素对酿酒酵母细胞的强胁迫或毒性作用，导致酿酒酵母厌氧乙醇发酵性能不稳定、不理想的问题，显著提升了厌氧乙醇发酵菌体细胞浓度、糖醇转化率及乙醇生产强度等生产指标。