一种快速检测液体烟用香精香料中菌落总数的方法与流程

本发明涉及液体烟用香精香料中微生物检测，具体涉及一种快速检测液体烟用香精香料中菌落总数的方法。

背景技术：

1、烟用香精香料种类繁多，组分复杂，富含微生物生长所需营养成分，其质量状况倍受企业关注。在烟草行业自主调香的大背景下，各企业均在逐步建立烟用香原料库和香精香料调配中心，如何对入库香原料的质量符合性进行快速判定以及调配香精、料液的稳定性进行科学评价，成为企业生产过程中面临的现实问题。而菌落总数是评价烟用香精香料卫生质量状况的重要指标，已被纳入国家和烟草行业香精香料相关标准管控指标，也是影响其稳定性的重要因素之一。目前，烟用香精香料菌落总数检测标准方法为gb 4789.2《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，所规定的平板倾注法操作复杂，费时费力，检测结果受人为操作影响较大。由于该方法检测门槛较高，行业内有能力开展微生物检验的实验室较少，样品多数依赖委托检验，因微生物检测要求样品具有时效性，给检测送样工作带来较大的不便。因此，亟待开发适合于企业香精香料入库检验和日常监测的简便、不需要特殊实验室条件和人员要求的菌落总数快速检测方法。

2、快速测试片法由传统平板计数法演变而来，本质是一种预先制备好的一次性培养基系统，其测试基本原理和培养方法与传统方法相同，但无需培养基配制和灭菌处理等前期准备工作，具有操作简便快速、节约空间、易于判读等优点。测试片方法已被美国、法国和我国列入食品中菌落总数检测的标准方法，也被食品、医药生产企业用于现场检验。近年来，测试片法在食品菌落总数检测中得到广泛应用，大量文献验证了在适合的测试片基础上，测试片法结果与国标法结果一致性好。由于烟用添加剂种类繁多，基质复杂，目前暂无采用测试片测定烟用香精香料的菌落总数的报道。

3、目前市售菌落总数测试片产品种类较多，主要以冷水凝胶和无纺布为载体的测试片应用较多，其中冷水凝胶为载体的测试片以美国3m公司petrifilmtm菌落总数测试片(3m-ac测试片)和日本dnp公司medi·ca ac细菌总数测试片(dnp-ac测试片)为代表，而无纺布为载体的测试片以默克公司生产的mc-media细菌总数测试片(mc-ac测试片)为代表。通过代表性标准菌株和典型样品，系统比较各类型测试片的性能，科学验证各测试片类型对种类繁多，基质成分复杂烟用香精香料的适用性，可为烟用香精香料的质量管控提供有效简便快速的检测方法，也可为烟用香精香料的变质评估、监测预警提供方法支撑。

4、测试片上承载的培养基组分较少，与国标pca培养基量较别较大，在相同的接种量(1ml)上，测试片更易受基质影响。在日常检测烟用香精香料菌落总数时发现，部分样品颜色较深，若直接接种于测试片，会严重影响菌落的判读和计数，同时部分香精香料含有较多的甘油、丙二醇等溶剂，同时也会添加适量的防腐剂以加强烟用香精香料抵抗微生物的能力和延长储存时间，以上因素均会影响菌落总数测试片法在烟用香精香料的分析应用，造成其检测结果与gb 4789.2《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》差别较大。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速检测液体烟用香精香料中菌落总数的方法，以求克服基质效应和颜色干扰，方法便捷高效、适用于各类型液体烟用香精香料中菌落总数的检测。

2、为此，本发明提供了如下的技术方案：

3、一种快速检测液体烟用香精香料中菌落总数的方法，包括以下步骤：

4、s1.按照无菌操作方式，量取液体烟用香精香料样品，无菌滤膜抽滤；

5、s2.将步骤s1中抽滤后的滤膜装入无菌均质袋，加入无菌磷酸盐缓冲液，均质，制成样品匀液；

6、s3.将步骤s2中的样品匀液依次制成递增系列稀释样品匀液；

7、s4.打开测试片的覆盖膜，滴加步骤s3中稀释样品匀液在测试片的中央处，待稀释样品匀液自动扩散至整个接种区，完全被吸收后，轻轻合上覆盖膜；

8、s5.将测试片的透明面朝上，水平放置，然后进行培养，培养完成后，判读计数菌落数量。

9、可选的，所述步骤s1中，所述无菌滤膜的孔径为0.45μm；和/或

10、所述步骤s1中，量取液体烟用香精香料样品10ml-25ml。

11、可选的，所述步骤s2中，加入无菌磷酸盐缓冲液90ml-225ml，所述量取的液体烟用香精香料样品的体积和所述量取的液体烟用香精香料样品和加入无菌磷酸盐缓冲液的体积之和的比值为1:10；和/或

12、所述步骤s2中，所述无菌磷酸盐缓冲液中磷酸二氢钾浓度为42.5mg/l，ph为7.2：和/或

13、所述步骤s2中，将无菌均质袋置于拍击式均质器内均质；

14、可选的，所述拍击式均质器采用中档水平，对样品进行均质2-5min。

15、可选的，所述步骤s3中，将步骤s2中的样品匀液依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。

16、可选的，所述步骤s4中，滴加步骤s3中稀释样品匀液1ml在测试片的中央处；和/或

17、所述步骤s4中，垂直滴加步骤s3中稀释样品匀液在测试片的中央处；和/或

18、所述步骤s4中，所述测试片采用基于冷水凝胶载体的菌落总数测试片；和/或

19、所述步骤s4中，所述覆盖膜以所述测试片的对角线方向打开。

20、可选的，所述步骤s5中，所述培养的条件为温度为36℃±1℃，培养时间为48h±2h；和/或

21、所述步骤s5中，培养时，所述测试片的堆叠片数≤20片。

22、可选的，判读计数菌落数量的方法包括目视、用菌落计数器、放大镜、自动菌落计数器或所述测试片判读手册计数菌落数。

23、可选的，在判读计数菌落数量时，若所述测试片上存在液化区，选择未液化区域的包含有菌落的小方格(1cm2)计算平均菌落数，再乘以20，可得到整个所述测试片上的菌落数。

24、可选的，所述测试片中含有一种指示染剂可使菌落显示红色，计算所有红色菌落(不论其大小和颜色深浅均需计算)。

25、可选的，因为在菌落总数测试片上菌落是红色的，可与不透明的不规则形状的杂质样品颗粒区分开。

26、本发明技术方案，具有如下优点：

27、1.本发明提供的一种快速检测液体烟用香精香料中菌落总数的方法，包括以下步骤：s1.按照无菌操作方式，量取液体烟用香精香料样品，无菌滤膜抽滤；s2.将步骤s1中抽滤后的滤膜装入无菌均质袋，加入无菌磷酸盐缓冲液，均质，制成样品匀液；s3.将步骤s2中的样品匀液依次制成递增系列稀释样品匀液；s4.打开测试片的覆盖膜，滴加步骤s3中稀释样品匀液在测试片的中央处，待稀释样品匀液自动扩散至整个接种区，完全被吸收后，轻轻合上覆盖膜；s5.将测试片的透明面朝上，水平放置，然后进行培养，培养完成后，判读计数菌落数量；上述方法中，采用菌落总数测试片对液体烟用香精香料中菌落总数进行测定，通过改进优化检测步骤，和现有技术相比，可有效克服香精香料中复杂基质成分对微生物生长的影响，及避免颜色较深样品对菌落的判读影响，使结果与国标法更加吻合，同时具有操作简便迅捷，减少工作量，运输、携带和贮藏方便，培养占用空间小，培养时间短，易于判读，菌群生长形态清晰，检测结果稳定可靠等优点。