一种表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA疫苗及其制备方法

本发明涉及核酸疫苗领域，具体而言涉及一种表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna疫苗，包含该mrna合成质粒的构建，该mrna的合成制备，该mrna疫苗的制备方法。

背景技术：

1、猫杯状病毒病(felinecaliciviral disease，fcvd)是由猫杯状病毒(felinecalicivirus，fcv)引起的一种以上呼吸道感染为主要症状的疾病，该病主要侵害7-84日龄幼猫，常发于56-84日龄，1岁以下的猫最易感，日龄越小的猫感染后死亡率越高，潜伏期2-3日，自然病程7-10日。其主要临床症状表现为口腔溃疡、肺炎、慢性胃炎、关节炎及跛行等。猫表现为精神沉郁、眼、鼻分泌物增多，有时流涎和出现角膜炎。自1957年fastier首次分离鉴定fcv以来，在欧洲、美洲、亚洲均发现fcv，其已呈世界性分布。近年来，由于fcv高度的变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性全身性疾病(virulent systemic disease，vsd)，对猫及猫科动物的健康造成严重威胁。被列为猫的三大病毒性传染病之一。fcv属于杯状病毒科(calicivirudae)疱疹病毒属(vesivirus)，为二十面对称的球形无囊膜的单股正链rna病毒，直径35～39nm，基因组大小约为7.8kb。基因组编码3个开放阅读框(orfs)。orf1编码非结构蛋白，包括2c解旋酶、3c半胱氨酸蛋白酶以及3d rna依赖的rna聚合酶；orf2编码主要衣壳蛋白vp1；orf3编码一个小的结构蛋白，即vp2。

2、vp1蛋白是一种结构蛋白，在病毒粒子的形成、抗原决定以及病毒-宿主细胞的相互作用中起到关键作用。vp1拥有大部分中和抗体表位，是重点研究对象。vp1基于其序列的保守分析，进一步分为a-f六个区，a区位于vp1的氨基末端，在形成衣壳蛋白的过程中被剪切掉，位于1aa-125aa之间；b区含有潜在的肉豆蔻化甘氨酸和atp/gtp结合位点，位于126aa-397aa之间；c区为一短的高变序列，约位于398aa-401aa之间；d区高度保守，位于402aa-426aa之间；其中e区大约427-524aa，又进一步被28个保守碱基(cone)分成5′端(33aa)和3′端(34aa)两个高变区(hrv)，可能是cone决定了fcv只有一种血清型，且e区还是产生中和性单克隆抗体(mab)的区域，含有多个抗原表位；f区位于衣壳蛋白高度保守的羧基端，是非中和mab的连接位点位于525aa-668aa之间。

3、相比传统疫苗，mrna疫苗作为新型疫苗的形式，具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低。相较与dna疫苗，mrna疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，半衰期可以通过修饰进行调整。mrna疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可以诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。

技术实现思路

1、本发明针对现有猫杯状病毒疫苗产品中存在的不足，提供了一种预防或治疗的猫呼吸道病的表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna疫苗制备方法及其应用。

2、本发明的技术方案：

3、一种重组mrna合成质粒，包括质粒骨架序列、编码猫杯状病毒vp1蛋白的基因；所述猫杯状病毒vp1蛋白的基因序列如seq id no.1所示，所述猫杯状病毒vp1蛋白的基因缺失5’端第4-372位核苷酸序列。

4、其中，猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)属于杯状病毒科病毒(calicivirudae)，主要侵害7-84日龄幼猫，引起上呼吸道感染为主要症状。

5、其中，fcv的vp1蛋白拥有大部分中和抗体表位，是主要的抗体免疫点。由于vp1蛋白结构分为a-f六个区，其中a区位于vp1的氨基末端，在形成衣壳蛋白的过程中被剪切掉，为此对vp1蛋白基因第4-372位核苷酸序列进行缺失改造。

6、所述质粒骨架序列包括t7启动子序列、5’utr区、3’utr区和3’末端polya尾。重组mrna合成质粒可构建于任意克隆载体，polya尾末端保留一个bsa i限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。

7、优选的，所述限制性内切酶位点为bspq i、bsa i或mlu i。

8、还包括甲病毒非结构蛋白基因编码区；所述甲病毒非结构蛋白基因编码区为非结构蛋白1-4基因编码区，编码猫杯状病毒vp1蛋白基因序列经过密码子优化；优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(vee)。vee复制酶基因nsp 1-4区，包含vee病毒复制酶基因序列，表达的vee病毒复制酶能够在体内合成mrna，起到复制mrna的功能。

9、本发明还提供了所述的重组mrna合成质粒在制备预防猫杯状病毒引起的猫呼吸道病的疫苗中应用。

10、本发明还提供了一种表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna，包括5’utr区、3’utr区和3’末端poly a尾、编码猫杯状病毒vp1蛋白突变体的mrna；所述猫杯状病毒vp1蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

11、还包括委内瑞拉马脑炎病毒复制酶1-4编码区的mrna。

12、优选的，还包含5’帽结构，所述5’帽结构为7-甲基鸟苷帽结构。

13、其中，表达vp1蛋白的基因mrna序列大小为1913bp(序列如seq id no.3所示)，表达vp1蛋白基因复制型mrna序列大小为9426bp(序列如seq id no.4所示)。

14、本发明还提供了一种表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna疫苗，包含所述表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna。

15、目前，mrna疫苗主要以两种序列结构存在，传统的非复制型mrna序列和自扩增型(复制型)的mrna疫苗序列。自扩增型mrna序列含有复制酶基因，可在细胞内扩增mrna，从而以较少的mrna剂量生产较多的抗原。非复制型的mrna疫苗结构简单，在人体内无法自我复制，需要成熟的优化工艺才能在较低的剂量诱发有效的免疫应答。

16、本发明还提供了所述的mrna疫苗的制备方法，将所述表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna与阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇脂质和胆固醇混合制备成脂质纳米颗粒，通过微流控装置或混合透析后获得所述复制型mrna疫苗。

17、具体步骤为：

18、(1)将所述重组mrna合成质粒t7-vp1使用限制性内切酶进行线性化处理；

19、(2)对线性化的t7-vp1质粒利用t7启动子序列进行体外转录反应，提纯获得vp1-mrna；

20、(3)对获得vp1-mrna使用牛痘病毒加帽酶和2′-o-甲基转移酶通过酶法进行cap加帽修饰反应，提纯获得cap-vp1-mrna；

21、(4)加帽修饰的cap-vp1-mrna与阳离子脂质(sm-102)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇、聚乙二醇脂质(dmg-peg2000)按照比例通过微流控装置或混合透析后获得lnp-vp1-mrna疫苗。

22、本发明还提供了所述猫杯状病毒vp1蛋白的mrna疫苗作为预防猫杯状病毒感染中的应用。使用lnp-vp1-mrna疫苗免疫后的动物体内存在针对猫杯状病毒vp1蛋白的特异性抗体，具有预防猫杯状病毒感染的作用。

23、本发明的有益效果：

24、本发明制备了一种表达猫杯状病毒vp1蛋白的mrna疫苗，构建包含猫杯状病毒vp1蛋白的mrna载体质粒，并用于制备mrna，结合脂质体包裹方案制备mrna疫苗，并应用于猫杯状病毒的免疫。该方法在猫杯状病毒研究和疫苗创制上具有应用价值，能够大力推进疫苗的转化应用。