一种干细胞因子组合物及其在治疗伤口愈合中的应用的制作方法

本技术涉及生物领域，具体的涉及一种干细胞因子组合物及其在治疗伤口愈合中的应用。

背景技术：

1、干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞。在一定的条件下，干细胞可被诱导分化为多种功能细胞。而干细胞因子是指可靶向调控干细胞的干性维持、定向分化等特性的重要因子，以及由不同的干细胞或基质细胞产生的在干细胞治疗中对其修复损伤具有关键作用的活性因子。干细胞因子可以是转录因子、生长因子，也可以是某些分化抑制因子及趋化因子等因子。

2、创面愈合是一个错综复杂的生物学过程，该过程通过细胞因子的高度协调介导细胞与细胞间或细胞与基质间的相互作用来修复受损组织。细胞因子的协调不良或功能障碍均可导致创面愈合“失控”，在临床上表现为创面难愈。近年来应用干细胞分泌因子治疗难愈性创面的研究已有报道，相关动物实验证实其具有良好的创面愈合能力。研究发现，通过皮下注射结合局部涂抹缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞50倍上清浓缩液的方式治疗小鼠全层皮肤创面，在给予治疗的第3，7，10，14天测量伤口大小，发现骨髓间充质干细胞上清液治疗组较纤维母细胞上清液治疗组有10％的创面愈合度提高，且愈合速度明显高于对照组。采用皮下注射与局部涂抹相近年来应用干细胞分泌因子治疗难愈性创面的研究已有报道，相关动物实验证实其具有良好的创面愈合能力。通过皮下注射结合局部涂抹缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞50倍上清浓缩液的方式治疗小鼠全层皮肤创面，在给予治疗的第3，7，10，14天测量伤口大小，发现骨髓间充质干细胞上清液治疗组较纤维母细胞上清液治疗组有10％的创面愈合度提高，且愈合速度明显高于对照组。采用皮下注射与局部涂抹相结合的方式应用羊水来源的间充质干细胞上清浓缩液(5倍浓缩液)对小鼠全层皮肤创面进行治疗，结果显示在治疗的第6天，创面愈合度相比于deme/f12培养基治疗组有40％的提高。近期研究表明羊膜多能干细胞培养上清中含有大量创面愈合相关因子。进一步的研究显示，注射羊膜多能干细胞上清液治疗大肠杆菌感染的全层皮肤烧伤大鼠的实验结果显示，在治疗后的第25天，隔周上清液治疗组较感染对照组伤口愈合度有15％的提高，而增加注射频次即隔天注射更可提高20％的伤口愈合度。值得关注的是，国外已有机构正在开展应用人羊膜多能干细胞分泌因子，以皮下注射的方式治疗急性部分皮层烧伤的临床试验。因此，在皮肤创面愈合治疗中，干细胞因子具有较好的应用前景。

3、细胞外基质包括各型胶原，蛋白多糖和弹性蛋白，在组织创伤修复过程中具有重要意义。基质金属蛋白酶mmps是一组由效应细胞分泌参与ecm降解的蛋白酶，影响组织修复、重塑和疤痕形成。其活性受金属蛋白酶组织抑制因子timps影响。mmps过度表达在伤口修复时是不利的，因此，开发抑制mmps的抑制剂是有必要的。

4、除了内源性抑制剂timps外，对mmps药物抑制剂的研究一直都没有停止过，先后有接近60种药物抑制剂面世，主要想应用于癌症、关节炎、各种心血管疾病以及慢性阻塞性肺疾病的治疗。然而因为安全的原因致多数药物抑制剂停止了使用，一个主要的原因就是与剂量相关的副作用。o一二氮菲(0一phenanthroline)是基质金属蛋白酶广谱有效的抑制剂，是一种小的有机化合物，可能透过细胞膜，作为实验室理想的抑制剂。但是对实验结果的解释需要谨慎，因为它可能还有其他(如氧自由基的清除)作用。类似的抑制剂有抗肿瘤药物巴马司他(batimastat)、马立马司他(marimastat)、gm-6001以及pd-166793，这些药物具有同样的作用机制就是潜在锌离子螯合作用。尽管这些药物有很好抑制炎症及抗肿瘤血管增生作用，但在晚期癌症患者使用时发现最主要的副作用就是肌骨骼综合征(mss)，这可能与它过度的抑制及非选择性有关。于是选择性抑制剂显得更为重要，使用抑制肽选择性抑制明胶酶mmp-2和mmp-9，能阻止底物与活性位置相结合。但是对水解酶很敏感所以很快失去作用，只能作为有效的实验和药理工具。另外在缺血再灌注以及促炎症细胞因子刺激心脏模型中，mmp-2中和抗体也能显示很好的保护作用。最具有临床影响的基质金属蛋白酶抑制剂就是四环素类抗生素，它是被美国食品与药物管理局及卫生管理局认可的唯一可应用于临床的基质金属蛋白酶抑制剂。其中脱氧土霉素被认为是最有效的mmps抑制剂，它经化学修饰失去抗菌效果后能抑制mmps活性，并且在低于治疗浓度的剂量下也能抑制mmps的活性。关于mmp-2结构及其功能在近40多年已经得广泛、深入的研究，但对其功能及信号转导的机理还没完全搞清楚，关于特异性的mmp-2活性抑制剂的研究，也没有取得令人兴奋的进展。但是各种有益的信息逐渐显现，在心血管疾病中，钙离子拮抗剂和他汀类药物有针对mmp-2活性的抑制作用，可能有利于斑块的稳定；中药广泛应用于肿瘤、关节炎和各种心脑血管疾病等的治疗，效果良好，目前已发现黄芪、人参皂苷、原花青素、丹参酮等均有抑制mmp-2的作用。但是发现和开发新的高选择性mmp-2抑制剂，也必将有助于疾病的临床诊断与治疗。

技术实现思路

1、在皮肤伤口愈合的过程中，mmp-2的过度激活导致mmp-2与其抑制剂的失衡，严重影响了胶原合成，使创面经久不愈，因此，开发mmp-2的抑制剂是有意的。

2、本发明以mmp-2重组蛋白为免疫原，制备获得了特异性的针对mmp-2的单克隆抗体m2a6、m3f5等三个单克隆抗体。其中，本发明的mmp-2的单克隆抗体m3f5其重链可变区氨基酸序列为seq id no.1所示，所述抗mmp-2重组兔单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为seq id no.2所示。

3、本文描述的任何抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，抗原结合片段是fab片段、f(ab')2片段或单链fv片段。在一些实例中，抗原结合片段是fab片段、f(ab')2片段或单链fv片段。在一些实例中，抗体是人抗体、嵌合抗体或单链抗体。

4、本发明的mmp-2单克隆抗体通过特异性验证，结果显示不与bsa或者mmp-7或者兔血清反应，具有较好的特异性。并且通过小鼠大剂量注射实验证实了其具有较好的安全性，无明显毒副作用。

5、进一步的，本发明提供了一种用于促进皮肤愈合同时减少疤痕生成的药物组合物，所述组合物含有本发明的mmp-2的单克隆抗体以及重组人干细胞因子。

6、进一步的，本发明提供了一种治疗皮肤损伤减少疤痕生成的方法，所述方法包括在伤口发生后，先给予重组人干细胞因子治疗后，在伤口发生3-7d给予含有本发明的mmp-2的单克隆抗体以及重组人干细胞因子的组合物治疗，能够加快皮肤伤口愈合，减少疤痕生成。

7、进一步的，本发明提供了mmp-2的单克隆抗体以及人干细胞因子在制备用于促进皮肤愈合同时减少疤痕生成的药物组合物中的用途；其中，所述用途包括在伤口发生后，先给予重组人干细胞因子治疗后，在伤口发生3-7d给予含有本发明的mmp-2的单克隆抗体以及重组人干细胞因子的组合物治疗，能够加快皮肤伤口愈合，减少疤痕生成。

8、进一步的，含有本发明的抗体或此抗体的功能性片段的药物组合物包括在本发明范围内。

9、进一步的，药物组合物除所述抗体或此抗体的功能性片段之外，优选包括生理上可接受的稀释剂或药物载体，或可以是一种与其他药物(如其它抗体或抗生素)的混合物。

10、合适的药物载体包括：生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水葡萄糖溶液、缓冲生理盐水，但不限于这些载体。

11、此外，抗体可以是冻干的和在必要时添加上述缓冲液后得到重建。给药方法包括：口服给药、或肠胃外给药如口腔内、气管支气管内、直肠内、皮下注射、肌肉注射、静脉注射等给药，优选给药方法优选静脉注射给药和皮下注射给药。可通过各种制剂形式进行给药，这些剂型包括：气雾剂、胶囊、药片、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏剂和胶布制剂。

12、被制成液态制剂如乳剂时，可使用添加剂如：水；糖类如蔗糖、山梨醇和果糖等；醇类如聚乙二醇、丙二醇等；油类如芝麻油、橄揽油和大豆油等；防腐剂如对羟基苯甲酸酯类等等。被制备胶囊、药片、粉剂、颗粒剂等时，可使用添加剂如：赋形剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖、和甘露(糖)醇等；崩解剂如淀粉、海草酸钠等；润滑剂如硬脂酸镁和滑石粉等；粘合剂如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和凝胶等；表面活性剂如脂肪酸酯等；增塑剂如丙三醇等。注射制剂可使用的添加剂包括：水；糖类如蔗糖、山梨醇、木糖、海藻糖、果糖等；糖醇如甘露(糖)醇、木糖醇和山梨糖醇等；缓冲液如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和谷氨酸盐缓冲液等；表面活性剂如脂肪酸酯等。

13、进一步的，本发明的mmp-2的单克隆抗体其重链可变区氨基酸序列为seqid no.1所示，所述抗mmp-2重组兔单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为seqid no.2所示。

14、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链和重链可变区进行合适的氨基酸替换，以使得替换后的可变区序列分别与重链可变区氨基酸序列seq id no.1和轻链可变区序列seq id no.2保持90％以上同源性的同时，还保留相应的抗体活性。

15、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链和重链可变区进行合适的氨基酸替换，以使得替换后的可变区序列分别与重链可变区氨基酸序列seq id no.1和轻链可变区序列seq id no.2保持95％以上同源性的同时，还保留相应的抗体活性。

16、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链和重链可变区进行合适的氨基酸替换，以使得替换后的可变区序列分别与重链可变区氨基酸序列seq id no.1和轻链可变区序列seq id no.2保持97％以上同源性的同时，还保留相应的抗体活性。

17、进一步的，本发明的单克隆抗体可以在轻链和重链可变区进行合适的氨基酸替换，以使得替换后的可变区序列分别与重链可变区氨基酸序列seq id no.1和轻链可变区序列seq id no.2保持99％以上同源性的同时，还保留相应的抗体活性。

18、进一步的，本发明还提供了一种抑制细胞中mmp-2活性的试剂，所述试剂包含本发明的mmp-2单克隆抗体。

19、进一步的，本发明还提供了mmp-2单克隆抗体在制备用于抑制细胞中mmp-2活性的试剂中的用途。

20、有益效果

21、本发明以mmp-2重组蛋白为免疫原，制备获得了特异性的针对mmp-2的单克隆抗体，该抗体能够有效的抑制mmp-2的表达且随着浓度的增高抑制效果持续增强。干细胞因子具有促进伤口愈合的作用，将其与mmp-2单克隆抗体一起在合适的时间内添加使用能够有效的促进伤口愈合以及减少疤痕的生成，具有较好的应用前景。